RNAi——双链RNA引起的基因敲除（2）
在构建双链RNA的表达载体时，使用RNA多聚酶Ⅲ来指导RNA的合成。这是因为RNA多聚酶Ⅲ有明确的启始和终止序列，而且合成出的RNA不会带有polyA尾。当RNA多聚酶Ⅲ遇到连续5个胸腺嘧啶时，它指导的转录就会终止，并且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来。U6启动子能被RNA多聚酶Ⅲ识别，
合成出RNA。ShiYang[10]等人用Bluescript作为载体，U6作为启动子，从绿色荧光蛋白（GFP）的基因上选择了一个21个核苷酸的片断（片断1），将其插入到Bluescript载体中。然后合成出片断1的反向重复序列，并在其后加了5个胸腺嘧啶，称为片断2。他们将片断2接到
Bluescript载体中片断1的后面，将载体转移到细胞中后，转录出的RNA由于具有回文序列，会形成一个发卡样结构，从而得到了双链RNA。片断后面加了5个胸腺嘧啶，RNA转录到这个位置时就会终止。而且转录出的RNA形成发卡样结构后，会在3’端形成2个突出的尿嘧啶，这类似于天然的
siRNA,因而有利于双链RNA诱发RNAi。
RNA多聚酶Ⅲ还能识别H1-RNA 启动子。在H1-RNA 启动子后面接上能形成发卡样结构的反向互补序列，将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA[9]。
T7也可作为启动子合成dsRNA。将PCR产物用NotI酶切后自身连结，回收正向片断和反向片断连结形成的具有反转重复序列的片断，接到pGEMTeasy载体上，就构建成了可以表达dsRNA的载体。用此载体可先在体外合成dsRNA,或将其转入到细胞内合成dsRNA。在后一种情况下，还须将能表达T7RNA多聚酶的载体也一起转入到细胞中，以提供能识别T7启动子的RNA多聚酶[11]。
双链RNA只能短暂抑制哺乳动物细胞的基因表达。而具有发卡结构的双链RNA能够增加阻断基因表达的时间。在小鼠畸胎瘤细胞，胚胎干细胞，C2C12细胞中，用长链具有发卡结构的双链RNA有效的阻断了报告基因的表达，在稳定表达具有发卡结构的双链RNA
的细胞株中，报告基因的表达被长期的阻断了[12]。
腺病毒是体内转基因的常用载体。Xia HaiBin等用腺病毒做载体，在体内和体外表达dsRNA,并成功的阻断了基因的表达，从而实现了成体动物的基因敲处[13]。
四. RNAi的应用
1. 高通量的研究基因功能
在后基因组时代，需要大规模高通量的研究基因的功能，由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，因而RNAi成为研究基因功能的很好的工具。研究者将线虫三号染色体上2232个基因对应的dsRNA合成出来，并注射到线虫性腺内，然后观察子代细胞分裂时出现的异常表型，结果发现了133个基因与细胞分裂异常有关。其中104个基因以前没有发现有这种功能。在另外一项研究中，线虫一号染色体上的2416个基因对应的dsRNA被构建到细菌文库中，然后将细菌喂给线虫，观察形态学的异常，异常的运动，性别比例的变化，不孕的情况，结果将于这些表型有关的基因从70个增加到178个。
2. 基因敲除
在线虫的体内外试验中，RNAi都能达到基因敲除的结果，从而成为研究这些基因功能的良好工具。对于哺乳动物，RNAi能在体外培养的细胞达到基因敲除的效果，对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，它成为研究信号传导通路的良好工具。在线虫体内，胰岛素和受体结合后可以活化DSOR1,它是MEK的类似物，DSOR1活化后可以激活ERKA,它是ERK的类似物。用以DSOR1为靶目标的dsRNA可以阻断DSOR1的表达，虽然总的ERKA的表达不受影响，但由于DSOR1的表达被抑制，因而胰岛素刺激后ERKA不能活化。RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因，如可用RNAi来阻断某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中其起着关键作用。
3. 基因治疗
目前抑制基因表达常采用反义技术或转入没有功能的突变体与该基因竞争。这两种方法对基因表达的抑制都不如RNAi高效特异持久。作为基因治疗的工具，RNAi既高效特异，又简便易行。RNAi在某个基因表达异常增高引起的疾病中会非常有用，如病毒感染，肿瘤等。CDK-2是调控细胞周期的一个关键基因，用以CDK-2位靶目标的dsRNA能阻断99.7%的细胞中CDK-2的表达，而在对照中只有0.2%
的细胞中CDK-2基因的表达降低[10]。因而，以CDK-2位靶目标的dsRNA能治疗细胞异常增殖相关的疾病，如肿瘤等。DsRNA还可以抗病毒治疗。研究者们将HIV-1编码rev的基因和与它同源的双链RNA共转染到293细胞中，rev基因的表达被显著抑制[14]。CD4基因编码细胞表面
HIV病毒的受体，用针对CD4的dsRNA能将细胞表面HIV病毒的受体表达减少75%，从而抵抗HIV病毒的感染。
4. 基因表达调控
今年研究者发现RNAi在Epigenetics中发挥重要作用。Epigenetics是指至少一代的基因表达的改变，而基因的编码没有改变。今年研究者发现，epigenetics调控的一种类型是染色体的改变。通过改变染色体的形状（更紧或是更松），能够决定那一个基因表达。但什么促进了染色体形状的改变以前并不清楚。今年研究者发现，siRNA在染色体形状的改变中起着非常重要的作用。这样
RNAi能永久的关闭基因的表达，而不仅仅是短期的抑制它。通过在发育过程中关闭或开放基因的表达，siRNA可能指导着细胞的定向分化。RNAi已被证实能引导植物干细胞的分化，因而研究者认为RNAi也可能参与指导人的干细胞的分化。由于RNAi在基因表达调控中发挥重要的作用，对RNAi微小的干扰就可能导致肿瘤的发生。
目前RNAi在非脊椎动物如线虫，果蝇，以及植物中的应用已经取得了很多重要的成果，但在哺乳动物中的应用还处于起步阶段。在哺乳动物细胞中，RNAi并不能完全阻断基因的表达，特别是表达异常高的基因。Tuschl等人的研究工作中，有三个基因被抑制了
90%，但有一个基因没有被抑制，这就是一个表达很高的基因。另外，运载体系一直是体内基因治疗的瓶颈，如何将双链RNA高效特异的转入体内仍是一个难题。目前已能用腺病毒作为载体在体内实现RNAi,但仍需要寻找更为安全有效的载体。
