氧化型谷胱甘肽含量测定试剂盒使用说明
氧化型谷胱甘肽含量测定试剂盒说明书
分光光度法 50 管/48 样
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
GSH/GSSG 是细胞内最重要的氧化还原对之一。因此，测定细胞内 GSH 和 GSSG 含量以及
GSH/GSSG 比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态，也是谷胱甘肽氧化还原循环的主要指标之一。
测定原理：
利用 2-VP 法测 GSSG 含量。自备仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。试剂组成和配置：
试剂一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 150μL×1 支，4℃保存。
试剂三：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。
试剂四：液体 6mL×1 瓶，4℃保存。
试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 40 mL 试剂三溶解，现配现用。
试剂六：液体 30μL×1 瓶，-20℃保存。临用前加入 0.6 mL 试剂三稀释，4℃保存。
粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清液（如上清不清澈，再离心 3min）待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议500万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；8000g 4℃离心 10min，取上清液（如上清不清澈，再离心 3min）的蒸馏水混匀待测。
3. 血清等液体：直接测定。
测定操作:
1. 分光光度计预热 30 min，调节波长到 412 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂三置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴中保温 30min。
3. 测定管：取 1 mL EP 管，加入 100 μ L 上清液，2 μ L 试剂二，盖紧后混匀，置于 37℃水浴 30min；开盖后依次加入 100 μ L 试剂四，700 μ L 试剂五，10 μ L 试剂六，迅速混匀后， 测定 30 s 和 150 s 光吸收 A1 和 A2，计算ΔA=A2-A1。
GSSG 含量计算公式:
1、标准条件下测定的回归方程为 y=0.0325x+0.046；x 为标准品浓度（nmol/mL），y 为吸光值(ΔA)。
2、 按蛋白浓度计算
GSSG（nmol/mg prot）=(ΔA-0.046)÷0.0325×V 样÷(V 样÷V 样总×Cpr)
=30.77×(ΔA-0.046)÷Cpr
3、按样本鲜重计算
GSSG（nmol /g 鲜重）=(ΔA-0.046)÷0.0325×V 样÷(V 样÷V 样总×W)
=30.77×(ΔA-0.046)÷W
4、按细胞数量计算
GSSG（nmol/104 cell）=(ΔA-0.046)÷0.0325×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞数量)
=30.77×(ΔA-0.046)÷细胞数量
5、按照液体体积计算
GSSG（nmol/mL）=(ΔA-0.046)÷0.0325×V 样÷V 样
=30.77×(ΔA-0.046)
V 样：反应中加入样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积， 1mL；W：样品质量，g，
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
注意事项：
1. 提取过程中去掉蛋白质，所以提取液不能用于测定蛋白含量。
2. 临用前配制的试剂配好后 4℃保存，2 天内使用完毕。
3. 最低检出限为 0.1μmol/L。
4. 反应温度.严格来说，为保证重复性，应在 25℃下进行反应。
5. 反应时间需精确控制，否则会影响反应速率计算，产生较大误差。
6. 样品中的 GSSG 浓度尽可能低一些，否则反应速率太大，没法控制，所以稀释倍数要尽量大些。
