燕麦转基因及其在提高渗透胁迫耐受中的应用实验（一）
实验材料 燕麦
试剂、试剂盒 乙醇蒸馏水Clorox 漂白剂
仪器、耗材 培养皿MSI 培养基
实验步骤
1. 芽尖培养
( 1 ) 成熟的燕麦（Ogle、Pacer 和 Prairie ) 种子用于芽尖培养。
( 2 ) 徒手去除种子的外稃和内稃。
( 3 ) 种子用 70% 乙醇（Sigma) 浸泡 5 min 进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水洗一次，再用 20% 的 Clorox 漂白剂浸泡，并在旋转振荡器上以 0.5 g 持续振荡 30 min (VWR International, Bristol, CT 06011) (见注 1) ，用无菌蒸馏水洗二次。
( 4 ) 在无菌条件下将种子放入装有湿润滤纸的培养皿后，覆盖一层湿滤纸，将培养皿在 3~5°C 放置 2~3 天以使种子适应处理条件。期间要经常加水保持湿度。
( 5 ) 放置结束后，将 10~12 粒经过消毒的种子放入倒有 MSI 培养基的（25 mL/每皿）无菌培养皿（100 mm x15 mm，直径x高；VWR ) 中萌发，在生长室或 25°C 生长箱中暗培养一周（见注 2) 。
( 6 ) 种子萌发后，用无菌的刀片（Sigma) 将芽尖切成 3~5 mm 的小段（见注 3) 。
( 7 ) 将 5~7 个切好的芽水平放置在倒有 MS2 培养基的培养皿中（100 mmx15 mm ) ，在 25°C 持续光照条件下培养4 周 [ 60 μmol/( m2·s ) 采用 40W 功率的冷白光 Econ-owatt 荧光灯管，Philips Westinghouse, USA ] ( 见注 4 ) 。
( 8 ) 每周进行一次继代培养，从培养的芽尖将伸长的叶片、胚芽鞘和茎移除，然后再切成 3~5 mm 的小段。
( 9 ) 每 2 周用 MS2 培养基进行继代培养以保持丛生芽的生长 [ 图10.2 (a ) ]。
( 10 ) 培养 8 周后计算每一品种丛生芽的相对分化频率，即产生丛生芽的芽尖数与培养的总芽尖数的百分比（见注 5 ) 。
2. 微粒轰击
( 1 ) 取 30 mg 金粉或钨粉置于 1.5 ml 离心管（VWR) ，加入 1 ml 100% 乙醇髙速涡旋振荡 30 min 进行消毒，用于基因枪轰击。
( 2 ) 在振荡过程中，取 50 μl 微粒乙醇悬浮液到新的离心管中，并用微量离心机(Brinkman, Westbury， NY 11590) 10000 g 离心 30s，然后加入 1 ml 蒸馏水，涡旋振荡洗涤并离心。洗两次后，用 332 μl 无菌蒸馏水重悬微粒。
( 3 ) 在重悬的微粒中加入 15 μl DNA 样品，其中含有 15 μg 阳摩尔比为 1 : 1 的 pBY520 和 pActl-D 质粒、225 μl 的 2.5 mol/L CaCl2 (Sigma) 、50 μl 0.1 mol/L 亚精胺 (Sigma) ，室温下涡旋振荡 5 min (见注 6) 。
( 4 ) 将微粒- DNA 悬浮液在冰上放置 10 min，然后 10000 g 离心 1 min。
( 5 ) 用 500 μl 100% 乙醇清洗微粒-DNA 沉淀，涡旋振荡 30s，离心 1 min，然后用 100 μl 100% 乙醇重悬微粒。
( 6 ) 根据大小将 2~3 个丛生芽放置在铺有 MS3 培养基（25 ml/皿）的培养皿中直径为 1.5 cm 的区域内，然后将培养皿放在基因枪的终止屏下方（见注7) 。
( 7 ) 吸取 10 μl 微粒-DNA 悬浮液加在载体膜（macrocarriers) 中心，待乙醇挥发后立即用于轰击（见注 8) 。
( 8 ) 2 h 后对每一个芽尖培养物再进行一次轰击（见注 9) 。
( 9 ) 将轰击后的芽尖移到新鲜的 MS2 培养基上（25 ml/皿），在 25°C 持续光照 [ 60 μmol/( m2·s )] 条件下生长 4 周，期间进行一次继代培养 [ 图 10.2 ( b ) ]。
3. 转基因组织的选择
( 1 ) 4 周后，将基因枪轰击过的丛生芽分成直径 5~10 mm 的小块（避免损伤芽分生组织），然后每皿放 6~8 个芽丛于 MS4 培养基上（25 ml/皿；100x15 ) ，并计算转基因事件的相对发生频率（表 10.1)。
( 2 ) 2 周后，将转基因的芽（绿色的）在新鲜的 MS4 培养基上进行继代培养，去除非转基因的芽（黄色或褐色）。
( 3 ) 在 MS4 上选择培养 4 周后，将绿色的丛生芽分成直径为 5~10 mm 的芽丛，在 MS5（25 mL/皿，100x20 ) 培养基上继代生长 4~6 周。
( 4 ) 经过总共 4 个月的选择和增殖后，将快速生长的丛生芽移至带有 MS6 培养基（50~70 ml/Magenta) 的 Magenta 盒（99 mmx 68 mm，长X直径，Sigma；2~3 芽丛/Magenta) 中进行营养生长，然后移至 MS7（50~70 ml/Magenta) 培养基中进行生根培养 [ 图 10.2 ( c ) ]。
( 5 ) 当转基因植株长到 5~10 cm 高、有 2~3 个叶片时，移植到含混合土的 8 cm 塑料罐中，其中泥炭和珍珠岩按 1 : 1 混合，每罐一棵。在 16 h 光周期、70%~80% 湿度的温室中生长直到成熟 [ 图10.2 (d) ; 见注 10]。
( 6 ) 让转基因植株自花授粉结实，收种，按株系独立保存在 4℃ 和 70% 湿度的环境中。
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