燕麦转基因及其在提高渗透胁迫耐受中的应用实验（二）
4. 转基因遗传分析
( 1 ) 低温处理后，种子（每皿 10~12 粒）在 MS7 ( 25 ml/皿）培养基上萌发 1 周，用于分析转基因的遗传特性，如在 R。、R1、R2 代中 bar 基因的遗传稳定性（见注 11)。
( 2 ) 或者在温室中，利用多孔塑料盘（Griffin Green House and Nursery Supplies) 在土中（Metro Mix 360 Soil) 萌发种子并生长 2 周。用除草剂喷洒生长的植株（见注12)。
( 3 ) 1 周后，统计选择培养基上萌发和未萌发的种子数，或温室中除草剂处理后存活和死亡的植株数。
( 4 ) 采用 X2 检验（53 ) 分析转基因在 R。、R1、R2 代的分离（表 10.2)。
5. 转基因植株的分子检测
(1) 聚合酶链反应（PCR)
① 转基因植株中转基因的检测（如 bar 和 hav1) : 用叶片遵照 REDExtract- N-Amp Plant PCR试剂盒（Sigma- Aldrich， St. Louis, MO, Cat# XNA- P ) 的说明书操作提取 DNA。
② 使用正向（F ) 和 反向（R ) PCR 引物：例如，bar- F：5'-ATGAGCCCAGAACGACG-3'；bar- R：5'-TCA GATCTCGGTGACGG-3'；hva1-R：5' -TGGCCTCCAACCAGAACCAG-3'；hva1- R：5'-ACGACTAAAGGA ACGGAAAT-3’。
③ 在 PCR 仪（如 Per-kin Elmer/Applied Biosystem， Foster City, CA) 上进行 DNA 扩增。扩增反应起始用 94°C 变性 4 min，随后 94°C 1 min、55°C 1 min、72℃ 2 min 进行 35 个循环，最后 72°C 延伸 10 min。
④ 在 0.8% (m/V) 的琼脂糖凝胶分离并分析 PCR 产物，凝胶用 EB 染色后在紫外灯下观察。转基因条带大小分别是： bar 为 0.59 kb，hva1 为 0.70 kb [ 图 10.3 ( a ) ]。
(2) Southern 杂交分析
① 用基因编码区（如 hva1 或 bar1 ) 序列作为探针进行 Southern 杂交 [54]。
② 用 Phytopure 植物 DNA 提取试剂盒（Amersham-Pharmacia Biotech) 提取转基因和非转基因植株的基因组DNA。
③ 用 10 μg R0、R1 和 R2 代植株的基因组 DNA 进行 Southern 杂交分析。
④ 用 HindIII 和 HindIII-BamH I 限制酶酶切消化基因组 DNA，然后在 0.8% 的琼脂糖胶上电泳分离片段。
⑤ 将胶变性和中和并印迹到 Hybond-N+ 膜上（Amersham-Pharmacia Biotech) , 依照 Sambrook 等描述的方法[55]。
⑥ 用 HindIII-BamH I 酶切 pBY520 质粒，在 0.8% 的低熔点胶上分离带有 hva1 编码区的片段。切下 1.0 kb 的片段，用 QIAquick PCR 纯化试剂盒纯化该片段。
⑦ 用 Rad 引物标记试剂盒（GIBC0 BRL) 对纯化的基因特异的 DNA 片段进行 [ 32P] -dCTP 放射性标记，方法参照说明书。
⑧ 按照标准程序[ 55 ] 用 hav1 基因特异探针与准备好的膜进行杂交。
⑨ 随后，-80°C 条件下用 X 光胶片（Kodak ) 放射自显影分析杂交膜 [ 图10.3 ( b )]。
(3) Northern 杂交分析
① 用 TRIZOL (GIBCO BRL) 提取转基因和非转基因植株幼叶的总 RNA，方法参照说明书。
② 依照 Sambrook 等的方法在 1.2% 的琼脂糖-甲醛变性胶中电泳分离 10 μg 总 RNA [55]。
③ 依照 Sambrook 等的方法将股印迹到 Hybond-N+ 尼龙膜（Amersham-Pharmacia Biotech) 上 [55]。
④ 按照标准的 Northern 杂交程序 [55]，用 32P 标记的基因特异的探针分析 hva1 的转录情况 [ 图 10.3 ( c ) ]。
(4) Western 杂交分析
① 蛋白质提取、Western 杂交和免疫检测参照 Xu 等的方法[48]。
② 在液氮中研磨约 0.1 g 转基因和非转基因植株的新鲜叶片，加入 0.2 ml 蛋白提取缓冲液提取蛋白质。
③ 用 Bio-Rad 蛋白分析试剂（ Bio-Rad) 按 Bradford 的方法测定每一样品的总蛋白浓度 [56]。
④ 用 12% SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 100 μg 转基因和非转基因样品的可溶性总蛋白。
⑤ 电泳结束后，使用半干转移系统（ Bio- Rad ) 将蛋白质电转到硝酸-纤维素膜上(Amersham-Pharmacia Biotech) ，方法参照仪器说明。
⑥ 将 Western 膜分别和转基因特异蛋白（如 HVA1 ) 免疫产生的一抗（ 如兔抗血清）及二抗（带有碱性磷酸酶的兔 IgG 的抗体，Sigma- Aldrich) 孵育。
⑦ 在碱性磷酸酶的缓冲液中进行膜显色 [ 图10.3 ( d ) ]。
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