Western Blot详解(原理、试剂、步骤及问题解答)-10
UUU. 怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道和band都能很直，是不是上样的量很重要，罐胶有什么技巧吗？想跑漂亮，是不是应该先小电压，再高电压，总体上电压小些会跑的好些?还有前面有人说电泳液平玻璃板会使电泳条带漂亮些?
解答：影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶，使胶不均匀。
VVV. 为什么提高大分子量蛋白的转移的时候，小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?
解答：小分子的蛋白在转移过程中，会透过膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透过去了。
WWW. 上次转染了1.6*106细胞，收集，收集到了400微升体积，加6*loading buffer，
95度煮5分钟，-20度，交替3次，离心，上样，7%分离胶，先80v跑进分离胶，在100v电泳至溴酚兰出胶，biorad半干转PDVF膜，15v转30分钟，预染marker全部进膜，转移后的胶考马斯亮兰染，可见残留的蛋白带，大分子量多些.blot时，封闭用5%奶粉TTBS
1小时，抗体稀释液TTBS，一抗(1:10，单抗上清，2000年制备)1小时，二抗(1:2000)1小时，均在室温.结果，50kd的小分子显色，160kd大分子未显色。
原因分析及准备改进：转染大容量的质粒(融合蛋白的质粒)的效率会相对较低，大分子量表达也会相对较低，加上大分子量蛋白的转移不完全，可能是我没有拿到大分子量条带结果的原因。另外背景稍微有一些脏(背景整体均匀一致)，估计是二抗的浓度高了些，准备降至1:5000，另外抗体稀释液准备改用5%奶粉TTBS，封闭改为室温2小时。这个过程有没有问题？
解答：首先分析你的整个实验步骤。我发现了两个比较大的毛病：
1、一抗用TBST稀释。按照我的理解，一抗最好用5%的TBST脱脂牛奶稀释，和你的封闭液相一致，这样可以降低背景。
2、“biorad半干转PDVF膜，15v转30分钟”，你是这么做的吗？因为我大部分时间是做的恒流转移，用的是0.1mA/膜，100kd--200kd转2小时。到最后电压会升到20v左右。你用恒压法，我不是很肯定你转30分钟能将大分子（160kd）的抗原转上去。我建议你最好能将时间延长，如果是恒流，可按我的做法；如果是恒压，可摸索一下，适当延长时间。有时候你的marker也有可能欺骗你，因为marker的量比较大，是很容易转上去的，实际上目标蛋白的量远远少于marker量。
我对你的结果分析如下：
1、你的结果很好，估计离目标不远了，很快就可以成功。
2、 没有160kd的带是因为你的转移时间过短，适当延长转移时间（我怀疑这是主要的问题）。
3、你的一抗用1：10，2抗可以降到1：5000，背景会低一点。
10. 方法的介绍
XXX. 我想将hbx转到hepg2 细胞里 通过检测hbx蛋白的水平来 检验转染的效率 不知道可不可行？
解答：Western Blot检测HBX蛋白的表达来检测转染效率不是一个好办法，建议还是：
1、最好是带有荧光标签的HBX转染来看转染效率，最可靠
2、其次，HBX和荧光载体共转染，相对说明问题
3、荧光载体单独转染，主要是看细胞好不好转了呵呵
转染效率高低荧光显微镜下一目了然了。有的细胞荧光强，有的细胞荧光弱，有的没有。所以HBX表达强很可能是少数细胞荧光强的结果，不代表转染效率。
YYY. 半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小好像都有关系，那么湿法转移是不是所有的转移条件都一样呢？一般的条件是怎样的？
解答：半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的；而湿转的话电流是恒定的，时间也是根据分子量而定。
ZZZ. 转膜时何为湿法，何为半干法？
解答：半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法；用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法。
AAAA. 为什么浓缩胶和分离胶的电压不一致？同样的电压可以吗？
解答：浓缩胶的目的使得loading 的样品能够在同一条水平线上进入分离胶
，如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前进入分离胶。而在分离是理论上（实际上也是）小电压长时间分离的效果会更好，但是在操作过程中没有必要等那么长的时间，所以就用大电压快点跑。
BBBB. 如果目的蛋白比较小，21和38kd，转膜时（Biorad的湿转仪）时间是否能缩短些？100伏电压，甲醇的量是否也可以相应增加？
解答：如果是小蛋白可以用小电压28V－36V，4－6hours，（4度）。甲醇10％－20％就可以了。
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综述
