Western Blot详解(原理、试剂、步骤及问题解答)-9
MMM. 磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？
解答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。我做的时候从未加过，都做出来了。
NNN. Western Blot中block的最短时间?
解答：每一步1小时足够了， 中间换抗体要洗的话多换液几次，每次时间10分钟就够，洗3次只要半小时。跑胶1小时，
转移1小时，block半小时就行，1抗1小时，洗半小时，2抗1小时，洗半小时，显色10分钟。一般跑两块胶，一块染色，
一块western。一天肯定完事，一般不用等到第二天。
OOO. 想用Western检测基因转染后细胞培养上清中表达的目的蛋白（定性），分子量为20KD，浓度约为几百ng/ml。蛋白样品需浓缩、纯化吗？如何浓缩、纯化上清液中的目的蛋白？对小分子蛋白Western blot时需特别注意哪些条件？
解答：按照你提供的浓度，如果做Western Blot，是不用浓缩样品的. 对于20kd的小分子的蛋白，Western Blot中要注意的是：
1、转移时的时间，
2、转移时的电流或电压.
3、transfer buffer 中加20%的甲醇.
4、可以用13-15%的分离胶.
PPP. 蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适？
解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。干转的话，用2.5 A/cm2， 30min就应该够了。湿转，按照bio-rad的说明，用100mA，也得要半个多小时吧。
QQQ. 需要测同一种蛋白质的总量与磷酸化的量，但相互间干扰太大，怎么办？
解答：将膜放入stripping buffer（SDS 2%，Tris·Cl (PH=6.7) 62.5mM，beta-巯基乙醇 100mM）中，50℃孵育30分钟，TTBS西三次，再重新加入一抗，进行另一种抗原的检测。
RRR. 做Western Blot实验时，发现转膜时的电流总是偏小，转膜的效率也偏低. 100V恒压转膜时的电流只有190mA左右，而以前都有250mA。体系和条件都和以前一样，只是环境温度比以前低了很多。
解答：有可能重复使用了转移缓冲液，随着离子的逐渐减少，电阻越来越大，当然恒压时电流越来越小了。建议更换转移缓冲液。反复使用不要超过三次。环境温度低是有利于转移的。
SSS.
我电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。转膜也是恒流，38mA，100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了，当然彼此的目的蛋白不同。所以，我想问题应该出在抗原和一抗上，不知对不对。一抗我买的是单抗，推荐的稀释度是1：100——1：1000。我用的是1：100。难道非要用多抗吗？按道理单抗也应该出条带呀！细胞用三去污剂裂解的，没有做定量，加巯基乙醇变性后，每孔上样20微升。提出的蛋白我保存在4度了，这样行吗？
解答：1、建议您用恒压进行电泳，先用70V，等跑过积层胶与分离胶的界限时，换用90-100V，再跑3小时左右。2、转膜可用恒流，但要根据你的膜的面积及所要检测的蛋白的分子量的大小来确定电流的大小，一般来讲，0.8-3.0mA/CM2，分子量大的蛋白就用的电流大些，譬如，你膜的面积是30CM2，蛋白的分子量是80KD，那么你就可以以2.0mA/CM2的条件进行，你就可以60mA的电流进行。3、我觉得你的抗体应该没问题。4、你提出的蛋白怎么保存在4度呢？我们实验事都是保存在-20度的，提出蛋白分装保存在-20度。
TTT. 目的蛋白是一种6KD的分泌性蛋白，RT－PCR就显示细胞中mRNA表达不高，估计将培养上清冻干浓缩后采用Western
Blot还可能检测不出，但如果用western，是否一定要用0.2μm的膜？用Tris-tricine
SDS－PAGE电泳，电泳时分别管制三层凝胶，分离胶用40％T丙稀酰胺（2.6％C）浓度为16.5％，另外两层都用30％丙稀酰胺，中间一层浓度为10％，积层胶浓度为4％，凝胶厚度1mm，转膜的条件试过30V70分钟，膜上可见到小分子蛋白marker的条带，似乎见到目的条带，上样量为60μg细胞胞浆总蛋白，转膜的条件怎么样合适？
解答：一定要用0.2μm的膜，并且转移的条件要摸索一下，小分子的Western不好做，要根据你的实验器材来定，一般你要是有prestained marker就可以参照一下，如果相应的分子量大小的marker转移的好就可以了。
