用SYBR Green Ⅰ进行定量PCR实验的最适读板温度
SYBR Green Ⅰ（ SG Ⅰ）是一种双链 DNA 结合染料，它在定量 PCR 实验中对核酸的灵敏检测和定量是非常有用的。但采用 SG Ⅰ也有一个潜在的缺点，那就是一些非特异的产物也能和染料结合并产生荧光信号。引物二聚体是最常见的假信号源，而且任何非特异的双链 DNA 的存在都会产生信号，这些荧光信号有可能被当作来自目标扩增序列的信号，特别是当目标序列的扩增量很少或者根本没有的时候。
因为引物二聚体的片段一般很小，它的熔解温度（ Tm ）通常都比目标 PCR 产物的熔解温度低。如果在高于引物二聚体的 Tm 但低于特异产物的 Tm 的温度下读板，由于引物二聚体已经变性，与之结合的 SG Ⅰ都脱离下来，因此这个时候检测到的荧光都来自于目标扩增序列。这就消除了因引物二聚体而产生的荧光信号。而在这个温度下，大部分的特异产物仍然保持双链形式与 SG Ⅰ结合。此时检测到的荧光信号，就没有了因引物二聚体而产生的信号，也就与特异扩增产物量的关联性更加紧密。（虽然其他形式的高 Tm 值的、非特异的双链 DNA 仍可能存在）。
在这里，我们展示了利用 SG Ⅰ在 Opticon 荧光检测系统（ MJ Research ）上检测双链 DNA 的定量 PCR 方案。采用了 5 个不同的读板温度用来选择出最佳的读板温度。在最佳读板温度下，非特意扩增片段的荧光信号对全部检测到的荧光信号的影响消减到最小。在最佳的参数设置下就可用来定量分析。虽然在一个温度范围内采用多次读板能对实验条件优化提供有效的帮助 , 但却没有必要选择多个读板温度下的数据进行后续分析。
实验方法
聚合酶，缓冲液和 SG Ⅰ的说明如前所述。不同的模板浓度分别进行 5 个重复的试验。各组分的母液浓度和加样体积见 TABLE.1 。可以准备多倍体积的没有加模板的混合液，然后分装来进行多个试验。
下列的β -actin 的引物用来扩增 295bp 的片段。
正向： 5 ’ -TCA-CCC-ACA-CTG-TGC-CCA-TCT-ACG-A
反向： 5 ’ -CAG-CGG-AAC-CGC-TCA-TTG-CCA-ATG-G
模板 DNA 是包含 2-Kb β -actin cDNA 插入片段的质粒。质粒的浓度进行了系列稀释，浓度从 10 10 copies/ul 到 1 copy/ul 。
混合好反应液后，将 PCR 管转移到 DNA Engine Opticon real-time system （ MJ Research ）的模块上，扩增反应在计算控温模式下进行，扩增程序见 TABLE 2 。
域值线的设定按照前文的描述。一般手动将域值线设定在荧光信号超过背景并且开始上升的位置。这个域值自动应用于每个样品孔，使得在该点处对标准品和样品比较能产生最一致的结果。
实验结果
图 1 中标准曲线所采用的读板温度是 86 ℃，图 2 中标准曲线所采用的读板温度是 80 ℃。标准曲线的 r 2 值在 86 ℃是 0.994 ，在 80 ℃为 0.979 ，它们之间没有太大的区别。但是对于 1 ， 10 ， 100 个拷贝数模板的反应体系在标准曲线上对应点的分析表明，在读板温度为 86 ℃时具有很好的线性关系，但在 80 ℃时这些点的线性关系降低，明显偏离了标准曲线。
可以通过图 3 的熔解曲线来解释这种差别。在图 3 里，不仅显示了 100 个拷贝模板（绿色）和 1 个拷贝模板（红色）反应体系的相关荧光纯度，也显示出了负的荧光密度对温度变化的一次求导图。对于高浓度的模板（绿色），单一峰的 Tm 值大约是 90 ℃。对于低模板浓度（红色），其熔解曲线有两个峰，主峰对应的 Tm 值大约是 83 ℃，可能对应的是引物二聚体或者其他的非特异的产物。小的红色的峰对应的 Tm 值为 90 ℃，代表的是特异的产物。
在低拷贝数模板的情况下，非特异的产物更有可能较早的形成。在扩增反应终止时其产量比目标序列的产量还要多。这就导致了非特异产物产生的荧光信号比目标产物产生的荧光信号还要强。读板温度分别设在 80 ℃和 86 ℃对于标准曲线的影响可以从图 1 和图 2 中看出。
对于模板拷贝数为 100 或者更低的样品， Tm 值为 83 ℃的非特异产物使得检测到的样品的荧光信号偏高。越高的荧光信号对应越早的循环数，从而降低了 C （ t ）值（图 2 ）。可以看出，低拷贝数模板的重复样品间的 C （ t ）值差异在读板温度为 80 ℃时比在读板温度为 86 ℃时大（比较图 1 和图 2 中圈定的点）。这些因素使得低拷贝模板的 C （ t ）值脱离了线性关系。
在 86 ℃时，非特异的产物已经解链， SRBR Green Ⅰ被释放，这个时候检测到的荧光信号都是由特异扩增产物产生的，因而准确地代表了双链 PCR 产物的量。值得注意的是，在读板温度为 86 ℃时，那些重复样品的数据点（尤其对于低拷贝的样品）彼此更接近，就表现出了很好的线性。因此，对这种目标扩增产物进行分析的最佳读板温度为 86 ℃。
结论
对于任何扩增反应，在 PCR 程序里设置多个读板温度能帮助使用者找到最佳的读板温度来进行数据分析。一旦找到最佳的读板温度，就可以在最佳读板温度下对任何数量的样品进行实验和分析。
参考文献
Morrison, T.B., Weis, J.J. and Wittwer, C.T. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR ? Green I monitoring during amplification. BioTechniques 24:954-962 (1998).
Amutan, M. and Batey, D. Real-time quantification of lamda and human genomic DNA using DyNAzyme II DNA polymerase in combination with SYBR Green I dye. Application Note Vol.1, No.1. MJ Research, Inc. (2002).
