实验分析仪器--高效液相色谱仪的色谱柱的相关知识
色谱柱
色谱是一种分离分析手段,分离是核心,因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好、分析速度快等。市售的用于 HPLC 的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、多孔炭等,其粒度一般为3μm、5μm、7μm、10μm 等,柱效理论值可达5万～16万塔板/m。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效;对于同系物分析,只要500即可;对于较难分离物质对则可采用高达2万的柱子,因此,一般10～30cm 的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。
柱效受柱内外因素的影响,为使色谱柱达到最佳效率,除柱外死体积要小外,还要有合理的柱结构(尽可能减少填充床以外的死体积)及装填技术。即使是最好的装填技术,在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的,靠近管壁的部位比较疏松,易产生沟流,流速较快,影响冲洗剂的流形,使谱带加宽,这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍粒径的厚度。在一般的液相色谱系统中,柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。
1、柱的构造
色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺钉等组成。柱管多用不锈钢制成,压力不高于70kg/cm2时,也可采用厚壁玻璃或石英管,管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效,减小管壁效应,不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度,其效果与抛光相同。还有使用熔融硅或玻璃衬里的,用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板,是烧结不锈钢或钛合金,孔径0.2～20μm(5～10μm),取决于填料粒度,目的是防止填料漏出。
色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类,尺寸规格也不同:常规分析柱(常量柱),内径2～5mm(常用4.6mm,国内有4mm和5mm),柱长10～30cm;窄径柱[narrowbore,又称细管径柱、半微柱(semi-microcolumn)],内径1～2mm,柱长10～20cm;毛细管柱(又称微柱,microcolumn),内径0.2～0.5mm;半制备柱,内径>5mm;实验室制备柱,内径20～40mm,柱长10～30cm;生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定的,目的是避免管壁效应。
2、柱的发展方向
因强调分析速度而发展出短柱,柱长3～10cm,填料粒径2～3mm。为提高分析灵敏度,与质谱(MS)联用,从而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2mm的微径柱(microbore)。细管径柱的优点是:节省流动相;灵敏度增加;样品量少;能使用长柱达到高分离度;容易控制柱温;易于实现LC-MS 联用。
但由于柱体积越来越小,柱外效应的影响就更加显著,需要更小池体积的检测器(甚至采用柱上检测)、更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能:输液泵能精密输出1～100μL/min 的低流量,进样阀能准确、重复地加入微小体积的样品。且因上样量小,要求高灵敏度的检测器,电化学检测器和质谱仪在这方面具有突出优点。
3、柱的填充和性能评价
色谱柱的性能除了与固定相的性能有关外,还与填充技术有关。在正常条件下,填料粒度>20μm 时,干法填充制备柱较为合适;颗粒<20μm 时,湿法填充较为理想。填充方法一般有4种:高压匀浆法,多用于分析柱和小规模制备柱的填充;径向加压法,Waters ZL;轴向加压法,主要用于装填大直径柱;干法,柱填充的技术性很强,大多数实验室使用已填充好的商品柱。
必须指出,高效液相色谱柱的获得,装填技术是重要环节,但根本问题还在于填料本身性能的优劣,以及配套的色谱仪系统的结构是否合理。
无论是自己装填的色谱柱还是购买的色谱柱,使用前都要对其性能进行考察,使用期间或放置一段时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件下(样品、流动相、流速、温度)的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在±5%或±10%以内。进行柱效比较时,还要注意柱外效应是否有变化。
一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数,如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称度和柱压降等。
4、柱的使用和维护注意事项
通常色谱柱的寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料,只能在pH 2～9范围内使用。柱子使用一段时间后,可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶,特别是一些被吸附在柱顶的填料上的有色物质更易看清。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷,使柱效下降,这时也可补加填料使柱效恢复。色谱柱的正确使用和维护十分重要,稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中,需要注意下列问题。
①避免压力和温度的急剧变化及任何机械振动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况,柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料,因此在调节流速时应该缓慢进行,在阀进样时阀的转动不能过缓。
②应逐渐改变溶剂的组成,特别是在反相色谱中,不应直接从有机溶剂改变为全部是水,反之亦然。
③一般说来色谱柱不能反冲,只有生产者指明该柱可以反冲时,才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
④选择使用适宜的流动相(尤其是 pH),以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱,分析柱是键合硅胶时,预柱为硅胶,可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”,避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
⑤避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内,需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。
⑥经常用强溶剂冲洗色谱柱,清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时,对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡,每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右,即常规分析需要50～75mL。
部分色谱柱的清洗溶剂及顺序举例:
硅胶柱以正己烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次冲洗,然后再以相反顺序依次冲洗,所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质,己烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次冲洗,再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液,那么可以省略最后用水冲洗这一步。此外,用乙腈、丙酮和三氟乙酸(0.1%)梯度洗脱能除去蛋白质污染。
⑦保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇,柱接头要拧紧,以防溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。
