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生物样品分析方法确证（一）

2018.3.07

前几期讨论了药品质量标准建立过程中的分析方法的确证，广受好评，今天小编来总结下药品临床前和临床研究中生物样品分析的分析方法的确证，生物样品分析一般指测定生物基质（血浆、血清、全血、尿、粪便、胆汁、组织等）中的药物浓度，和药品质量标准中的分析最大的不同是基质复杂，小分子化药一般采用LC-MS/MS方法检测。生物样品分析方法确证一般应包括：选择性、准确度、精密度、残留、线性范围、基质效应、回收率、最低定量限、稀释线性、稳定性（溶液中的稳定性、基质中的稳定性、样品处理后的稳定性、冻融稳定性）。由于生物样品分析方法要求的细则比较多，这部分将分成两篇介绍。

为了验证分析方法，除配制标准曲线外，还需要以待分析样品相同的空白基质配制质控样品，如果不能获得或难以获得与待分析样品相同的基质，采用其他基质代替时应说明原因。一般需配制成低、中、高三个浓度的质控样品（QC），低浓度（LQC）不高于3倍定量下限，中浓度（MQC）接近标准曲线中部，高浓度质控（HQC）约为定量上限的75%。

选择性（Selectivity）：使用至少6名受试者的空白基质来考察（动物基质可以用不同批次的空白基质），空白基质中的干扰组分的响应低于分析物定量下限（LLOQ）的20%（如果有多个分析物，每个分析物都需要考察），内标的干扰组分的响应应低于内标响应的5%。这里需要注意的是药典的指导原则中动物基质可以使用不同批次的混合基质FDA的指导原则中只说了需使用6批不同来源的空白基质，建议使用不混合基质考察。
准确度（Accuracy）：是描述测得值和真实值的接近程度，用相对偏差[(测得值-真实值)/真实值)]×100%表示，准确度又分为批内和批间准确度，批内准确度每个浓度至少需要5个样品，质控样品的测定的偏差应在±15%以内，LLOQ的测定的偏差应在±20%以内。批间准确度至少3个分析批，且至少应在2天进行，每个分析批每个浓度至少5个样品，质控样品的批间测定的偏差应在±15%以内，LLOQ的批间测定的偏差应在±20%以内。
精密度（Precision）：是描述分析方法重复分析的接近程度，通过多次测量值的相对标准差（变异系数）来计算，也分为批内和批间精密度，也是通过测定定量下限和低、中、高质控样品来考察，批内精密度每个浓度至少需要5个样品，批内的变异系数质控样品应±15%以内，LLOQ的批内变异系数应在±20%以内，批间精密度至少需考察3个分析批，且至少应在2天进行，批间的变异系数质控样品应±15%以内，LLOQ的批间变异系数应在±20%以内
最低定量限和标准曲线（Lower Limit of Quantification and Calibration/Standard Curve）：最低定量限是指能被可靠定量样品中分析物的最低浓度，标准曲线应尽量覆盖预期的浓度范围，至少应该包含6个校正浓度水平，同时还应该有零浓度样品（zero sample，含内标的空白基质处理样品）、空白样品（blank sample，不含分析物和内标的空白基质处理样品），至少考察3条标准曲线，校正标样的回算浓度的准确度和精密度不超过15%，定量下限在20%以内，75%的校正标样至少6个有效浓度（定量下限必须符合）符合这一标准，FDA指导原则还要求定量上限（ULOQ）的准确度和精密度都不超过15%。如果配制8个浓度标准样品，至少需要有6个点通过，其中最低点必须通过，如果同一浓度水平有多个样品或标准曲线点超过8个，那么需要样品总数的75%的点都通过，且必须至少包含6个浓度水平，同样最低点必须通过。