双酶切小技巧
A．任何时候2 种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积。
B．双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表（也可以向ebiotrade.com客户服务部索取），如果有一种buffer能同时使2 种酶的活力都超过70% 的话，就可以用这种buffer作为反应buffer. 如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和。
C．如果2 种酶的buffer成份相差较大或2 种酶的反应温度不同则必须分别做酶切。第1 种酶切后要考虑用酚抽、电泳或加热等方法使酶失活后再进行下一次酶切反应。厂家目录一般都会有相应的附录以供查阅各种酶的反应温度。有的酶可以用加热使之失活，有的则不行，这些信息也可以在有关附录中查询，也可以向ebiotrade.com客户服务部索取。
D． 第一次酶切后通过电泳确证酶切完全后可以从胶中回收DNA 片段再进行下次酶切，也可以在第一个酶切后直接用PCR 产物回收试剂盒或Nucleotide Removal Kit 纯化酶切样（只需5 分钟），保留少量样品做电泳分析之用，再进行下一次酶切。还可以用一种离心纯化管或叫做离心浓缩管（Eppendorf ，S&S 等厂家有售），将酶切样加入后离心，盐等成份被过滤掉而核酸则被截留在柱子中间的膜上，加入适量ddH2O ，离心以洗去膜上残留的杂质，再加几微升ddH2O 在膜上，将柱子反转插入新的eppendorf 管上，离心，即可将DNA 片段离下来，做下一次酶切。
E．特别注意：在双酶切载体时如果2 个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。比如质粒pLITMUS29 的多克隆位点中BamH I旁边有HindIII 位点，如果先切BamH I再切HindIII 时就会出现HindIII 切不动的情况，但是反过来就没问题。
