qpcr实验流程
Q-PCR 实验流程
一、实验前准备,每天早上到实验室后,先把超净工作台的紫外灯打开 15-20 分钟。2超净台前做实验,需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套,RNA 抽提需 带口罩。
3取 EP 管/枪头时需用镊子,不可以用使用过的手套直接取用。取完 EP 管/枪头后,袋子及时封好。@橡胶手套须放入超净台照射紫外,实验操作过程 中不得带出超净台,移液器在一天工作结束后调至最大量程,并用75%乙醇清洁移液器,枪头盒及超净台面。
G实验进行的过程中或观看实验时没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、总 RNA 抽提
1)细胞培养皿中细胞样品用 1*PBS 洗两次后,用1m 枪将 PBS 吸净,加入lml Trizol(invitrogen)溶液,吹打混匀,并吸至 1.5ml RNase free EP 管中使细胞充分裂解,室温静置 5min;
组织样品用液氮充分研磨,加入 1ml Trizol (Invitrogen)溶液,混匀,室温放置5min 使其充分裂解:(管盖与管壁都需标记样品名称)。
2)加入 200!1氯仿,剧烈振荡混匀 30s,使水相和有机相充分接触,室温静置3-5min;(离心时离心管按顺序排放,离心完毕,离心管的顺序也按顺序排好,
与第一步的顺序一致)
3) 4C下,14,000g 离心 15min,可见分为三层,RNA 在上层水相,移至另一个新的 RNase free EP 管:(用 20-200ul 的枪吸取上清,吸清时,枪头应沿着液面上层吸取上清,枪头不可碰到、吸到中间层)。
三、去基因组
使用 RNase-free的DNase I(Promega),按以下体系配置反应液,37C消化30min,65C灭活10min。