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甲醛变性琼脂糖凝胶电泳

2019.9.12

试剂、试剂盒	10XMOPS 电泳缓冲液甲醛甲酰胺 10X 加样缓冲液溴化乙锭琼脂糖 DEPC 处理的水
仪器、耗材	水平电泳装置水浴
实验步骤	(一）材料与设备 1) 水平电泳装置 2) 水浴 3)10XMOPS 电泳缓冲液：0.2mol/LMOPS(PH7.0)，20 mmol/L 乙酸钠，10 mmol/LEDTA(pH8.0) 4) 甲醛;37% 溶液（13.3mol/L) 5) 甲酰胺（去离子）：将 10 ml 甲酰胺和 lg 离子交换树脂混合，搅拌 lh 后用 Whatman 滤纸过滤，等分成 1 ml 于一 70°C 储存。 6）10X 加样缓冲液：10 mmol/LEDTA(pH8.0)，0,25% 溴酚蓝，0.25% 二甲苯青，50% 甘油 7) 溴化乙锭 8）琼脂糖 9)DEPC 处理的水 (二）操作方法 1) 凝胶制备：制 100 ml. 含冇 2.2mol/L 甲醛和 1I.5% 琼脂糖凝胶。将 1.5 g 琼脂糖溶解在 72 ml. 水屮，微波炉加热溶解后冷却到 55X：, 加入 10 ml10XMOPS 电泳缓冲液和 18 mL, 去离子甲醛，然后灌胶。 2) 样品制备；分光光度下测以确定的浓度。如果 RNA 浓度太低 (<lmg/ml)，可用乙醇或异丙醇沉淀浓缩。 3) 电泳：在 l.5 mL 的离心管中加入下列组分进行变性反应， RNA〔最多 20ug） 2ul 10XMOPS 2ul 甲醛 4ul 甲酰胺 10ul 溴化乙锭（200ug/ml) 1ul 混匀后，于 55℃ 保温 60 min 使 RNA 变性，冰中冷却 110 min, 离心，加 2ul10X 加样缓冲液混匀，置于冰上，上样电泳，用1XMOPS 作电泳缓冲液，直到溴酚蓝到达凝胶的底部。在紫外灯下观蔡结果。 4)RNA 的分子质量标记。①使用商品化 RNA 分子的大小标准.②利用细胞中两个主要核糖体 RNA:18S(约 2.lkb) 和 28S(约 4.5kb) 作分子质量参照。展开
注意事项	1) 为了获得高分辨率. 可以在凝胶中加入更多的甲酵. 以较低的电流如 20mA 电泳过夜。在冷室中跑胶或用循环泵防止过热，但不必一定如此。 2) 对样品的染色也可在电泳后进行，将凝胶置于溴化乙锭溶液（0.5ug/ml) 中染色 10 min„如果背景过高可在水屮脱色 30 min。 3) 含甲醛的琼脂糖凝胶较普通胶脆，应小心操作。 4) 在含甲醛的琼脂糖凝胶上,RNA 比等长的 DNA 迁移速度快，一般不用 DNA 标准分子质量参照物测量未知分子大小。 5) 用于 RNA 电泳的电泳槽要用去污剂溶液洗净，再用水冲洗，用乙醇干燥后再灌满 3% 的过氧化氢，于室温放置 10 min 后，再用 DEPC 处理的水彻底冲洗电泳槽。展开