二维聚丙烯酰胺凝胶电泳样品的溶解与还原
基本方案
| 实验方法原理 | 理想的 2-DE 溶解应能达到破坏所有非共价结合蛋白质复合物和聚积体，形成各个多肽的溶解液。如不能达到这一点，样品中结合牢固的蛋白质复合物可能使 2-DE 中出现新的蛋白质点，相应地表示单个多肽的点强度将下降。此外，溶解方法必须允许可能干扰 2-DE 分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除。最后，样品中蛋白质在 2-DE过程中必须保持可溶性 |
|---|---|
| 实验材料 | 蛋白样品 |
| 试剂、试剂盒 | 裂解缓冲液 |
| 实验步骤 |
1.溶解 样品溶解是 2-DE 成功分离蛋白质的最关键因素之一。最为普遍应用的 2-DE 蛋白质溶解方法仍然是以下几种物质的混合液（所谓“裂解缓冲液"), 9.5 mol/L 尿素， 4% (m/V) 的 NP40 、 1%(m/V) 的还原剂二硫苏糖醇 (dithiothreitol, DTT) 以及 2% (m/V) 相应 pH 范围的SCA。该配方适用于许多类型的样品，但并不是一种万能方法，其中在膜蛋白质的提取上就对此方法提出了挑战, 此后发现两性去污剂 CHAPS 可以有效溶解膜损白质, 特别是在浓度为 4% (m/V), 与 2mol/L 硫脲和 8mol/L 尿素混合物共用时。硫脲是一种比尿素具有更强能力的变性剂，但由于其水溶性差，不能单独使用，但在尿素浓溶液中其可溶性更好，因此尿素-硫脲混合物提高了溶解样品的能力令线性磺基三甲胺乙内酯 (sulphobetaine) 去污剂，如 SB3-10 或 SB3-12, 也见有效的溶解剂，但这些试剂与高浓度尿素不兼容, 当它们以 2% (m/V) 的浓度与 l mol/L尿素、 2mol/L 硫脲和 2%CHAPS 结合在一块使用时可以克服这此困难 。去污剂 SDS 能破坏大多数非共价蛋白质相互作用，对于膜蛋自的溶解非常有效但找阴离子特性使它不可能应用于 IEF 凝胶。但是， SDS 可用于 2-DE 前的前期溶解过程，在该方法中，样品首先用 l%(m/V) SDS 溶解、然后用常用溶解液（如裂解液）稀释，目的是为（用非离子或两性去污剂从蛋白质中置换出 SDS, 从而使蛋白质保持在溶解状态。为了有效地溶解样品，并减少 SDS 在 IEF 中的负作用，必须认真控制蛋白质与非离子或两性去污剂的比例 (1：3) 及 SDS 与非离子或两性去污剂的比例 (1：8),核酸对于 IEF 可能造成的问题，是因为它会导致样品黏度的增加且在某些情况下可与样品蛋白质形成复合物，进而导致假象迁移和条纹的出现。如果怀疑上述问题可能出现，最好向样品溶解液中加入适当纯的（不含蛋白酶）内切核酸酶来降解核酸，或是利用 SCA 和核酸结合形成复合物的能力通过超速离心来去除复合物. 2.还原 蛋白质二硫的通常用 DTT 或 β-巯基乙醇等含自由巯基的试剂还原，, 但是 DTT之类的试剂带电，因此在 IEF 过程中迁移到胶外，导致样品蛋白质的重氧化使得电泳过程中蛋白质溶解性丧失，最近报道用不带电荷的还原剂如三正丁基膦取代含巯基试剂大大增强一向 IEF 中蛋白质溶解能力，并使得一维到二维转移效率提高
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