RT-PCR PROTOCOL
RT-PCR PROTOCOL
材料与方法…………………………………………………………
1．材料 ………………………………………………………
1.1 供试用组织(细胞)…………………………………
1.2 主要仪器设备………………………………………
1.3 主要试剂……………………………………………
1.4 工具酶及试剂盒……………………………………
2.实验方法……………………………………………………
2.1 总RNA提取…………………………………………
2.2 RT-PCR………………………………………………
2.3 琼脂糖凝胶电泳……………………………………
材料与方法
1. 材料
1.1 供试用动物组织/细胞
1.2 主要仪器设备
1.5ml离心管、0.2ml PCR管、高速离心机、5~10ul加样器、2~20ul加样器、20~200ul加样器、TAKARA PCR仪、551可见光透射仪
1.3 主要试剂
RNAlocker、RNAout、RNAsaver、氯仿、异丙醇、75%乙醇、琼脂糖、SYBRGREEN I染料。
1.4 工具酶及试剂盒
TaKaRa One Step RNA PCR Kit
2. 方法
2.1 RNA提取和纯化
估算RNAout、组织或细胞的用量。取组织或细胞后，将剩余的组织或细胞放入RNAlocker中保存以备下次使用。将组织或细胞匀浆后，加入1.5ml离心管。加入0.2倍RNAOUT体积的氯仿，振荡混匀30秒。室温离心15000g 3分钟。将上清液转移到另一干净离心管中。在上清液中加入等体积的异丙醇,振荡器上振荡混均30秒。室温离心15000g 5分钟，RNA沉淀将在离心底的侧面形成，小心吸弃上清液。清洗：在含RNA沉淀的离心管中加入1毫升75%乙醇,振荡器上振荡混均30秒。室温离心15000g,1分钟。小心吸弃上清液。重复清洗步骤。将离心管倒置于滤纸上以干燥RNA。加DEPC水使RNA沉淀溶解，剩余的RNA沉淀使用RNAsaver溶解以备下次使用。
2.2 RT-PCR
2.2.1 取TaKaRa One Step RNA PCR Kit，按下列组成配制RT-PCR反应液。
10×One Step RNA PCR Buffer 5μl
MgCl2(25mM) 10μl
dNTP Mixture(10mM) 5μl
Rnase Inhibitor(40U/μl) 1μl
AMV RTase XL(5U/μl) 1μl
AMV-Optimized Taq(5U/ul) 1μl
上游特异性引物（20μM） 1μl
下游特异性引物（20μM） 1μl
Positive Control RNA或实验样品（≤1μg total RNA）* 1μl
Rnase Free dH2O 24μl
Total 50μl/Sample
*当目的RNA的表达数量较少时，可加至25μl。同时在反应体系中相应地应叫少Rnase Free dH2O的量。
2.2.2 按以下条件进行RT-PCR反应。
50℃ 30min RT反应
94℃ 2min RTase失活
94℃ 30sec
37℃~65℃ 30sec
72℃ 1~10min PCR反应25~30循环
● 当RNA为Positive Control RNA时，反应条件如下。
50℃ 15min RT反应
94℃ 2min RTase失活
94℃ 30sec
60℃ 30sec
72℃ 1.5min 25~30循环
2.2.3 反应结束后，取PCR反应液 (5 ~ 10 l) 进行琼脂糖凝胶电泳，确认RT-PCR反应产物。
如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。
Control反应时扩增片段大小为462 bp。
2.3 RT-PCR产物确认
电泳后，将SYBRGREEN I染色的凝胶用可见光透射仪观察结果，确认RT-PCR产物。
