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光镜与电镜技术--我的一点实验心得

2019.8.10

一般生物体是不透明的，不能直接在显微镜下观察其内部结构
 经过特殊的手段，减少体积和厚度，使光线能透过。
 基本原则：保持其原有的组织结构和相互关系。
制片方法的种类
 切片法
石蜡切片法、冰冻切片法等
优点：组织间的各种构造能保持正常的相互关系
缺点：切成薄片，不能看到完整的组织
 非切片法
整体封藏法：单胞藻、鸡胚、菌类等
涂片法：血涂片
压碎法：染色体
优点：操作简单，保持每个单位（组织）完整
缺点：由于受到压迫等，组成部分的正常位置关系有所变动
切片法的主要步骤（石蜡切片法）
 取材
 固定
 冲洗、脱水与透明
 透入与包埋
 切片与贴片
 染色
 封片与观察

取材
活体取材
 材料的新鲜：动物体死亡后，会产生一些变化（自溶）
 动物杀死的方法：避免使动物长时间陷于痛苦和濒于死亡的状态，以免使动物的组织细胞成分结构发生变化，或引起病理假象。
取材的要领
 迅速：减少组织细胞的死后变化
实验前对所取组织的结构、部位有明确的了解
熟练
 避免机械损伤：细胞、组织的变形
 组织块大小适中：与固定液有关
一般厚2~5毫米，长、宽不超过1.5X1.5毫米
 保持材料的清洁
用生理盐水冲洗组织块上的血液、污物和黏液等
 总之：尽量保持所取组织块在自然状态下的形态、结构。
固定与固定液
固定的目的
 迅速阻止组织、细胞的死后变化，防止自溶与腐败
 使细胞内的蛋白质、脂肪、糖等成分变为不溶性物质，以保持其原有状态
 使组织内各种物质成分产生不同的折光率，以便染色后易于鉴别和观察
 使组织块硬化，便于制作薄片，并在以后的过程中不易损坏
 使不同的组织成分对染料有不同的亲和力
固定的对象
 主要是蛋白质
固定液的性质
 有强的渗透力，能迅速渗入组织内部
 不使组织过度收缩或膨胀，并使组织内欲观察的成分得以凝固为不溶性物质
 使组织达到一定的硬度，并获得最佳的折光率、对某种染料的亲和力
固定的注意事项
 组织块不宜过大
 固定液的量以组织块大小的20倍为宜。
 最好能使固定液从上下左右前后同时渗入组织块
 必须选择渗透力强，又不使组织块过度收缩和膨胀的固定液
 固定时间的长短与材料的大小、性质、固定液种类、性质、渗透力强弱、温度有关
Carnoy液对组织的硬化作用强，不宜过长
Bouin液一般24小时，较长也无关系
增加温度可缩短固定时间，但组织变化大，尤其组织化学染色不宜。
 特殊要求的材料，需特殊的固定液
固定液的种类
 单纯固定液
乙醇、甲醛、升汞、乙酸、苦味酸、重铬酸钾、锇酸、铬酸、丙酮、三氯醋酸等
 混合固定液
Carnoy液
Bouin液
Zenker液
酒精-甲醛液（AF液）等
乙醇
 还原剂
 穿透速度快
 固定蛋白质效果好---不溶性物质
核蛋白固定后仍能溶于水
 缺点
组织容易变硬、脆
对组织收缩大—20%左右
能溶解脂肪、类脂、血红素及其他色素
避免固定线粒体、高尔基复合体
甲醛
 强还原剂
 一般市售为37-40%的水溶液，常用的10%甲醛液，实际含量4%左右
 渗透力强，固定均匀，收缩较少，硬化组织
但经酒精脱水、石蜡包埋时，强烈收缩
 非沉淀性固定剂，对脂肪、神经、髓鞘效果好，也可固定线粒体、高尔基复合体
 甲醛水溶液必须无色透明，若混浊或白色胶状沉淀—三聚甲醛，已变性
醋酸：冰乙酸
 能沉淀核蛋白，染色质的固定效果好
 穿透速度很快，一般大小的组织只需1小时
 不能沉淀白蛋白、球蛋白（细胞质的蛋白质）
组织不会硬化
 固定时可使组织膨胀
 高浓度醋酸会破坏线粒体、高尔基复合体
苦味酸：三硝基酚
 强酸，水中溶解度0.9-1.2%
 剧毒，能自燃、爆炸
 沉淀蛋白质，对脂肪、类脂无作用
 渗透力弱，组织不硬化
 固定后，收缩明显—50%左右
 固定的组织带黄色，一般情况下不需将它除去。
锇酸：四氧化锇，OsO4
 强氧化剂，剧毒
 对蛋白质固定均匀
不沉淀蛋白质，而使蛋白质凝胶化
 可固定脂肪、类脂体，使之不溶于酒精、苯
 穿透速度很慢，可保持组织的柔软，可防止组织经酒精时的继续硬化
 缺点：价格贵，固定不均匀
表面固定过度
深部没有固定
Carnoy液
 无水乙醇：冰醋酸：氯仿=6：1：3
无水乙醇：冰醋酸=3：1
 穿透速度快，但固定时间不宜过长，小块组织只需2-3小时
 无水乙醇：固定细胞质
 冰醋酸：固定染色质，防止酒精引起的组织硬化与收缩
 适宜于细胞学的制片，尤其是染色体
Bouin液
 饱和苦味酸水溶液：甲醛：冰醋酸 =15：5：1
 常用良好固定剂
 渗透力强，对组织固定均匀且收缩小，染色效果好，一般组织固定12-24小时
 苦味酸：沉淀一切蛋白质，但穿透速度慢，使组织收缩大，使组织适当硬化
 冰醋酸：穿透速度快，固定染色质，使组织膨胀
 甲醛：穿透速度快，调节前2种试剂对组织的膨胀作用
Zenker液
 升汞5克，重铬酸钾2.5克，硫酸钠1克，蒸馏水100毫升，冰醋酸5毫升
 重铬酸钾经醋酸酸化产生铬酸
 升汞：固定蛋白质，但穿透力弱
 铬酸：固定高尔基体、线粒体、肝糖，穿透速度慢，防止升汞过度硬化组织
 醋酸：固定染色质，穿透速度快，减少组织被铬酸收缩的倾向。
 组织学、细胞学、病理学常用固定剂。
冲洗、脱水和透明
冲洗
 材料经固定后，从固定液中取出，洗去固定液
 冲洗后，对组织块可以修切，将受挤压或不需要的部分修切、整形
 冲洗法：
 水洗法
 酒精冲洗法
脱水
 目的：祛除组织中的水分，并使组织变硬
 材料经固定、冲洗后，含大量水分，变软
 水和包埋剂不互溶
 重要性：
 脱水必须彻底，否则就会影响到透明、包埋、切片
 脱水的方法应逐步进行，以防组织过度收缩而变形
 脱水剂的特性
 能与水按比例混合
 高浓度：不含水
 能与透明剂混合（或者本身就是透明剂）
常用脱水剂
 单纯脱水剂（非石蜡溶剂）
 乙醇
 丙酮
 脱水剂兼透明剂（石蜡溶剂）
 二氧六环
 正丁醇
 叔丁醇
乙醇
 最常用的脱水剂，可与任何比例的水混合
 优点：价格低廉，操作简便，可回收，且能硬化组织
 缺点：易使组织收缩、变脆，非石蜡溶剂，不能直接用高浓度酒精脱水，必须采用一个浓度梯度
 一般组织从70%--100%
 柔软组织，如胚胎组织可从30%，甚至15%开始
 脱水时间按组织大小、种类、厚度而定
 如厚2-3毫米，一般100%以下每级1小时左右，100%的则应缩短
 脱水必须在有盖瓶子内进行，尤其是高浓度的时候
注意事项
 脱水时应循序渐进，级差不宜相差太大
 在低浓度酒精中，每级停留时间不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体
 在高浓度酒精中，停留时间也不宜太长，否则可使组织变脆，影响切片
 脱水应彻底、干净，否则与二甲苯混合后会产生乳白色浑浊
 如需过夜，应停留在70%的酒精中
丙酮
 多用于快速脱水或固定兼脱水
 脱水能力比酒精强，但对组织收缩较大
 能使蛋白质沉淀、组织硬化
 不能与树胶、石蜡混溶
二氧六环
 可与水、石蜡、酒精、二甲苯、树胶混溶
 优点：
 操作时间短，不须酒精、二甲苯，避免组织因此收缩、变脆
 组织可在其中停留：不会使组织收缩、变脆
 能溶解苦味酸、升汞，所以Bouin液和Zenker液固定的材料不须冲洗
 缺点：
 价格高，不能回收（易燃）
 有毒
 对有空隙的材料易产生气泡，妨碍透蜡
正丁醇
 能与水、酒精、石蜡混合
 优点
 很少引起组织收缩和变脆
 适用于制作植物标本
 缺点
 微溶于水，脱水能力弱
 一般经酒精脱水到80%再转入，或者与酒精混合脱水。
透明
 二次：组织块脱水以后、切片染色以后
 目的
 组织块：便于包埋剂的透入
 切片：有利于光线的透过，便于显微镜观察
 经过这一步骤后，光线可以透过，组织块呈透明或半透明状态—透明
 不能透明，说明脱水未尽，必须返工，而且返工后的效果不好。
 透明剂的选择：既能溶于脱水剂，又能溶于包埋剂，以便逐步将脱水剂置换成包埋剂。
透明剂
 二甲苯：
 石蜡包埋法中最常用
 溶于无水酒精，不溶于水，石蜡溶剂，有毒
 透明能力强，但易使组织收缩，变脆
从无水酒精—1：1—二甲苯
在二甲苯中不宜久留，小的30分钟，大的可适当延长
 如组织块不透明，呈白色浑浊—脱水不彻底
 还可用于切片透明
 有的兼溶的脱水剂可以不用透明
 其他的透明剂包括苯、甲苯、氯仿等
 透明能力差，但组织的收缩、脆化小

透入与包埋
透入
 将包埋剂透入整个组织的过程
 石蜡切片：透蜡，用石蜡取代透明剂，渗入软的组织使之变为适当硬度的蜡块，便于切片
 透明剂—1：1—纯石蜡
 总的透蜡时间：1-1.5小时左右，温度：40-60℃
 注意事项
 尽量保持在较低温度中，以石蜡不凝固为度
 尽量在最短时间内完成
 否则容易引起组织变脆、收缩
包埋
 包埋剂：石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等
 包埋方法
 熔剂法：包埋时是液体，冷后为固体
 挥发法：溶液为液体，溶剂挥发后为固体
 双重法
石蜡
 软蜡：熔点为50℃以下
 硬蜡：50-60℃
 选择石蜡的要点
 要使石蜡硬度与组织硬度相近
 切片较薄时（在8微米以下）用较软的
 室内温度（最重要）
 冬季：46-48℃
 10-19℃时：52-54℃
 夏季：56-58℃或更高
注意事项
 石蜡的硬度要适中
 太硬：切片易破碎，不易成蜡带
 太软：容易使蜡带皱缩，粘贴时很难摊平
 使用新蜡时必须经久煮炼，因新蜡内往往含有气体
 石蜡在温箱内经多次熔化后，熔点能一再升高，可超过65℃
 用过的废蜡加热过滤后仍可利用，且比新蜡好
 新蜡或旧蜡在使用前都应过滤1次以除去杂质。
透蜡的方法
 逐步
透蜡的要点
 石蜡要完全渗入细胞的每个部分，即使空泡内也要完全渗入
 石蜡要紧密而均匀地贴在细胞内外两面，使组织与石蜡成为不可分离的状态
透蜡的时间
 根据不同组织类型及其大小而定，与组织固定时间成正比
包埋的方法
可能出现的问题
 脱水不够彻底，有的部位特别是组织块中心石蜡难于渗入
 蜡块中出现“蜡花”。可能由于透明剂未能被熔蜡完全置换，或者蜡本身有杂质
 包埋时动作不能太慢：石蜡凝固
 冷却用水温度不能过高：石蜡凝固太慢会产生结晶。所以春秋冬三季可用自来水，夏季则应在水中加入冰块。
切片与贴片
石蜡切片法
 起始于十八世纪
 优点
 操作容易
 可切成极薄的片（4微米左右），能制作连续切片
 组织块可包埋在石蜡中永久保存
 缺点
 只能用于较小组织块，较大组织不易切好，容易破碎
 组织在脱水、透明过程中会收缩、变脆
 制片时间太长
火棉胶切片法
 优点
 包埋不用二甲苯及石蜡，不经高温，可避免组织收缩及变脆，适用于精细材料（脑）的切片
 火棉胶有韧性，切片不至于有折卷或破裂，适用于大块组织、多空洞组织（脑、眼球）、硬度较高组织（骨、肌腱）
 缺点
 手续麻烦，费时
 切片较厚，在10微米以上
 不能做连续切片
冰冻切片法
 将组织迅速冻成冰块而切片
 优点
 方法简便，时间短（十分钟左右即能制成切片）
 组织不经脱水、透明、包埋，所以没有显著的收缩，细胞形态不致有大的变化
 不需要经有机溶剂处理，能保存脂肪、类脂等成分
 缺点
 不能连续切片，
 切片较厚（10微米以上），易破碎
 染色也不及石蜡切片清晰，观察要有一定经验
 组织块不能过大，过大不易冰结
切片前的处理：修块
 将组织周围过多的石蜡切去，组织四周留约2毫米的边
 蜡块应修成方形或长方形
 蜡块的上下两边要求平行，否则以后切片时蜡带会弯曲
切片机的种类
 旋转式
 滑动式
切片刀的倾角
 10°以内
 过小:刀刃的边缘先与蜡块接触
 过大:刀口刮组织蜡块的边缘，切片易破碎
切片机的转速要均匀

切片常遇到的困难及矫正
切片不能形成蜡带
 室温过低
 石蜡过硬、黏度不足：加蜂蜡
 蜡边过小
蜡带弯曲：蜡带的两侧大小不等，刀不锐利
蜡片成卷：
 刀不锐利、不清洁
 刀的倾斜度过大
 石蜡过硬
切片出现皱褶
 石蜡太软、浸蜡不够
 刀钝、倾斜度不够
切片厚薄不等
 在脱水、浸蜡过程中处理不当
 刀钝、切片机不佳
 刀或组织块未固定牢固
组织块中的结缔组织呈不透明的白色
 脱水不彻底、透明不足—影响石蜡浸透
切片成碎卷状
 脱水、透明、浸蜡时间过久
 蜡温过高
切片出现纵纹
 刀刃有小缺口
 石蜡不清洁
切片出现横皱纹
 组织、刀固定不紧
蜡块底边成白色
 刀的倾斜度不足—碰撞
切片粘刀
 刀刃不洁、刀钝
蜡块向上运行时带走切片
 刀钝
 室温高、静电反应（过于干燥）

贴片（粘片）
目的
 将石蜡切片黏附在载玻片上，借水的张力和一定的温度，使略皱的蜡片伸展平整，以便染色、镜检
方法
 水捞法
 干粘法

染料与染色
染料的分类
 根据来源
 天然染料
 苏木素、胭脂红、靛青等
 人工合成染料（煤焦油染料）
 大都是从煤焦油中提取出来的
 根据发色团可以分为：亚硝基染料、硝基染料、偶氮染料（-N=N-）等
根据化学反应
 碱性染料
 大多是氯化物、硫酸盐、醋酸盐等
 一般作为胞核染色：苏木素
 酸性染料
 大多是钠盐，也可是钾、钙、铵盐
 作为胞浆染色：伊红
 中性染料：复合染料
 酸、碱性染料混合后中和而成
 如Wright染料、Giemsa染料
根据染色的对象
 胞核染料：苏木素、胭脂红等
 胞浆染料：伊红Y、苦味酸、苯胺蓝等
 脂肪染料：苏丹III、苏丹IV等

染色的原理
是物理与化学的综合作用的结果
 以前有物理学说和化学学说
物理作用
 毛细管作用与渗透作用
 组织有许多小孔
 吸收或溶液作用
 如苏丹染料溶于脂肪内
 吸附作用
 组织浸于染液中，色素粒子被组织吸附，进入组织粒子的间隙中
化学作用
 根据细胞内的不同化学成分，对染料有不同的亲和力，因此细胞有选择性的着色能力，使细胞的不同成分染成不同颜色
 细胞内有酸性部分和碱性部分的区别
酸性部分（核酸）易被碱性染料所染
碱性部分（细胞质）易被酸性染料所染
嗜酸性与嗜碱性
 染色与PH值有较大关系
蛋白质是两性物质
在PH值高于组织的等电点时，组织呈酸性，染碱性染料
在PH值低于组织的等电点时，则刚好相反

媒染剂、促染剂与分化剂
媒染剂
 能与染料和组织结合，使染料与组织发生染色现象，促进染色能力和生成色淀的金属离子的盐
 一般是二价或三价金属的盐或氢氧化物，常用的是铝盐、铁盐与明矾
 需要媒染剂的染料称为媒染染料，如苏木素等
 人工合成染料可不用媒染剂，但使用后往往可得较好的效果
促染剂
 不参与染色反应，增强染色能力
 如硼砂洋红中的硼砂
分化剂
 脱色剂
 脱掉组织和切片过染的染料
 酸性分化剂
冰醋酸：多用于合成的煤焦油染料
盐酸：多用于苏木精
 媒染分化剂
铁矾
 氧化剂
能把组织上所有的染料无选择地氧化为无色物质
简单的漂白作用，缓慢
如铬酸、重铬酸钾等

封藏
目的
 使切片能永久保存便于镜检
要求
 能与透明剂相混合
 对染料无影响
 折光率与玻片相似
 具有粘性
常用的封藏剂
 树胶
 淡黄色液体，可溶解于二甲苯、苯、氯仿等
 二甲苯、苯等易挥发，干固较快，无褪色等不良后果
 折光率接近玻片，透明度好，几乎无色，干后坚硬牢固
 注意事项
不可加热，否则变为深褐色
最好制成中性：酸性使碱性染料脱色