生物样品分析ISR及ISR失败原因浅析
生物样品的特点是成分比较复杂，包括基质、内源性物质和代谢产物等，而待测物的含量却很低（pg~μg级水平），这对分析方法提出了很高的要求，分析方法需要通过验证才能用于实际样品的检测，而生物样品分析方法验证的主要指标之一是方法的重现性，试验样品再分析（incurred sample reanalysis，ISR）是指用验证过的分析方法对试验样品进行再次分析。ISR是用于评价分析方法重现性最直观和有效的手段，用于方法验证的标准曲线样品和质控样品都是加样样品，将已知浓度标准溶液加入空白基质中配制而成，并不能完全模拟实际样品。由于蛋白结合，代谢物转化、样品均一性等情况都可能影响试验样品在已经验证过的分析方法检测结果出现大的偏差。所以通过ISR来验证生物样本分析方法的重现性非常必要。
2015版药典9012生物样品定量分析指导原则对于ISR也作了说明和相关的要求。必须进行ISR的实验是：毒动学实验，每个物种需要一次、所有关键性的生物等效实验、首次用于人体的药物试验、首次用于患者的药物试验、首次用于肝或肾功能不全患者的药物试验；数量是一般应重复分析10%的样品，如果样品总数超过1000，超出部分重新分析5%样品；建议选取获得Cmax附近和消除相样品进行再次分析；对于再分析的样品结果至少67%和首次测定的结果的偏差不超过20%。
报道的ISR失败率在5%左右，虽然ISR的失败率很低，但一旦失败，样品测定结果的准确性和重现性都会被质疑，甚至需要修改分析方法进行再确证。这一系列的工作都会消耗极大的人力和时间，本文简单介绍下可能造成ISR失败的原因，为分析方法开发和ISR失败原因调查提供参考。
一．人为因素
虽然人为因素造成的ISR失败是最不该出现的，但由于分析人员缺乏经验或者非主观故意的失误也会造成ISR失败，如样品贴错标签、位置摆放错误，样品处理前为完全融化，样品污染等等都会造成ISR失败。
二．药物不稳定
药物不稳定或者在生物基质中不稳定是很容易造成ISR失败的原因，这需要在方法建立的时候进行全面的考察，标准溶液、处理后样品、质控样品的稳定性经过考察后，处理样品应该严格按照考察稳定的条件下储存、转运、处理和分析样品。
还有一种情况是实际样品可能含有待测物的代谢产物，而方法确证样品是不含代谢产物的。实际样品中可能会有待测物和代谢产物相互转化的情况，或者代谢产物干扰待测物的检测的情况，文献报道的LC-MS/MS方法测定人血浆中依西美坦ISR-1失败，推测是前处理过程影响样品的稳定性，冰浴条件下进行样品前处理，ISR-2依然失败，分析原因发现，依西美坦与其血浆中的代谢产物存在可逆反应，室温条件下会互相转化，改变处理条件，使用液液萃取，前处理溶液和萃取剂都经过预冷且在冰浴下进行样品萃取，可以抑制代谢产物转化成待测物。因此方法开发过程中需要考虑代谢产物是否会转化成原药的问题。
三．样品前处理未严格按照确证方法进行
进行样品前处理的时候有可能会由于一些小的细节没有把握好造成测定结果的差异，例如涡旋震荡器进行样品混合提取时，由于有些涡旋震荡器的效力不是均匀的，会有部分样品提取的时候涡旋不充分，导致提取回收率低，而有些提取太充分导致一些干扰成分提取出来，影响了检测结果。还有一些是移液过程中使用的移液器不适合转移有机溶剂，导致移取的提取液体积不准，影响提取效率。
四．分析方法本身缺陷
分析方法本身缺陷导致的ISR失败，主要的有以下的方面：
1.
基质效应
如果分析方法的基质效应比较大，基质效应会随着样品浓度的改变而不同，或者未考虑特殊基质（如溶血和高血脂）的影响，或者内标和待测物的基质效应影响不同，内标响应的变化对ISR数据影响非常大。
2.
不同的蛋白结合率
由于有些药物和蛋白的结合程度不同，有些待测物在试验样品和方法确证样品中不同的回收率，如文献报道的硼替佐米与红细胞结合，硼替佐米提取回收率在试验样品和方法验证样品有10倍之多的差异，可能是硼替佐米与蛋白结合的过程是缓慢的或者体外情况下不容易结合。如果方法建立时没有考虑到这一点，就很容易导致了检测结果很难重现，ISR结果失败。
3.
分析方法的粗放度
有些分析方法在方法确证都可以通过，但实际样品时ISR不容易通过，如文献报道的氯吡格雷的生物样品分析方法，氯吡格雷的解离常数pKa为4.3，为了获得较好的提取回收率，提取过程中加入了PH3的缓冲液，但ISR失败，分析原因时发现确证样品不受影响，但实际样品经过酸性缓冲液的处理后，再测值和原值存在显著差异，改成PH为6的缓冲液后，ISR通过。
总而言之，避免ISR失败需要在方法建立时，需要对待测物的理化性质进行足够的了解，对基质对待测物的影响，以及待测物在基质的稳定性、提取过程的稳定性都需要全面考察；同时应避免一些人为因素导致结果测定的不准确。
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