蛋白质提取与制备(Protein Extraction and Preparation)-6
PH 值：
与沉淀蛋白质或酶原理相同，结晶的溶液PH 值一般选择在被结晶的蛋白质或酶的等电点附近，以利于晶体的析出。
温度：
除少数情况外，通常选择低温条件进行。低温条件对蛋白质和酶不仅溶解度低且不易变性。在中性盐溶液中结晶时，温度可在0℃至室温范围内选择，在有机溶剂中结晶一般要求温度较低。
晶种：
不易结晶蛋白质和酶如糜蛋白酶，往往加入微量的糜蛋白酶结晶可导致大量结晶的形成。有时用玻璃轻轻摩擦容器壁也可达到此目的。需加晶种才能形成结晶的蛋白质或酶，大多数结晶收率都不高。
金属离子：
有些蛋白质和酶结晶时还需加入金属离子，如铁蛋白在硫酸铵溶液中结晶时，加入少量镉离子才形成菱状结晶，烯醇化酶也常加入汞盐后形成结晶。
结晶时间：
在结晶条件比较适合的情况下，在几小时甚至几分名即可获得结晶。但有些情况需数天甚至数月才能结晶完全，视各种蛋白质和酶的具体情况不同而定。蛋白质和酶的结晶大多数是针状、棒状、片状，有的为八面体或立方体的菱状结晶。结晶的大小与结晶时间及条件有关。
干燥：
干燥是将潮湿的固体、半固体或浓缩液中的水分（或溶剂）蒸发除去的过程。根据水分在固体中分布情况可分为表面水分、毛细管水分和被膜所包围的水分3
种。表面水分附着于固体表面，蒸发时完全暴露于外界空气中，干燥最快、最均匀。毛细管水分存在于固体极细孔隙的毛细管中，水分子逸出比较困难，蒸发时慢并需较高温度。膜包围的水分如细胞中被细胞质膜所包围的水分，需经缓慢扩散至膜外才能蒸发最难除去。被干燥的物质其湿度与周
围空气的湿度是一个动态平衡关系，暴露于大气中的物质是不会绝对干燥的。若使被干燥的物质所含水分低于周围空气中水分，则必须放在严密封盖的容器中进行干燥。用这种方法可得到含水量极低的干燥样品，生物大分子制备得到所需的产品后，为了防止变质易于保存和运输，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥，某些无活性核酸、微生物酶制剂和酪蛋白等工业产品则较多地应用喷雾干燥、气流干燥等直接干燥法。
真空干燥
在相同温度下，被干燥物质所含水分或溶剂由于周围空气压力的降低蒸发速度增加。真空度愈高，溶剂沸点愈低，蒸发愈快。其原理与真空浓缩（或称减压浓缩）相同。真空干燥适用于不耐高温、易氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器、及真空泵3部分。干燥器顶部连接一带活塞的管道接通冷凝器，气化后的蒸气由此管道通过冷凝管凝聚，冷凝器另一端连接真空泵，干燥器内常放一些干燥剂如五氧化二磷、无水氯化钙等，以便干燥保存样品。
冷冻真空干燥
冷冻真空干燥除利用真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同的压力下，水蒸气压随温度的下降而下降。在低温下低压下冰很容易升华为气体。操作时通常将等干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。干燥后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。样品干燥时先在培养皿内铺成薄层（厚度不超过1cm
的液体），置于低温冰箱内冻固。另在真空干燥器内用两个培养皿分别放置固体氢氧化钠和五氧化二磷，真空干燥上端抽气通过五氧化二磷干燥管与真空泵相连。当放进等待干燥的冻块后，立即封闭干燥器，开动真空泵，红5～10h后得冷冻干燥品。也可将待干燥物质置于圆底容器中，然后浸入干冰-乙醇混合而成的冷却剂中，容器内液体迅速冻成固体，抽真空后等干燥冻块的水分子升华变成气体，经过冷凝器凝结为霜。冰冻的样品逐渐失去水分变成疏松的干燥粉末。上述操作关键在于真空泵的高真空度及管道的口径要合适。
喷雾干燥
喷雾干燥是将液体通过喷洒装置喷成雾滴后，与干燥介质（通常为热空气）直接接触干燥的方法。由于液体分散为雾滴时，直径通常只有1～200μm
大小，与热空气接触面大，水分蒸发很快。在100℃的热空气中只需不到1
秒的时间即可干燥。因干燥时间短和水分蒸发时吸收热量，使液滴及其附近的空气温度较低，故工业上常用。
样品贮藏保存：
保存方法和生物大分子稳定性有很大关系，生物大分子的贮藏保存可分为干态和液态贮藏两种。但不论是干态或液态贮藏均应避免长期暴露于空气中防止微生物的污染。温度对生物大分子的稳定性影响很大，低温保存在大多数情况下是有利的。
干态贮藏：
干燥的制品一般比较稳定，如制品含水量很低，要低温情况下物质大分子活性可在数月甚至数年无显著变化。贮藏方法也很简单，只将干燥后的样品置于干燥容器内（内装有干燥剂）密封，保存于0～4℃冰箱中即可。有时为了取样方便和避免取样时样品吸水和污染，可先将样品分装于许多小瓶中，每次用时只取出1
瓶。
液态贮藏
液态贮藏的优点是使样品免去干燥这一步骤，生物大分子的生理活性和结构破坏较少；缺点是需要较严格的防腐措施，贮藏时间不能太长，如样品量大时封装运输不方便，实验室常采取少量安瓿封存法。液态贮藏注意事项如下：
样品不能太稀，必须浓缩至一定浓度后才能封装贮藏，样品太稀时易引起生物大分子变性作用。
一般需加入防腐剂和稳定剂，常用防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外钙、锌、硼酸等盐溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸与氯化钠的标准缓冲液中。
贮藏温度要求较低，大多数在0℃左右冰箱保存即可，有的则要求更低温度，但注意某些具有活性的大分子如DNA 溶液低温保存时，不宜使溶液结冰以免其分子结构被破坏。另有文献报道某些蛋白质和酶在低温中反而引起变性。故应分加情况对待，不能一概而论。
总之，生物大分子的贮藏和保存，温度和水分是影响稳定性的两个主要因素。其次，各种稳定剂的应用是否适当关系也很大。实际应用时应全面加以考虑。
蛋白质纯度
蛋白质提纯以后需要有指标来说明它的纯度，从原则上看有许多制备纯化蛋白质的方法是可以将它们改成分析方法的，如各种分析的电泳、微量凝胶过滤法、各种层析、结晶出现、生物活力及免疫分析等。用一种方法一个条件来分析蛋白质的纯度是不够的。由于蛋白质数量多，性质相似者在所难免，一个条件下两个蛋白质不能分开的可能性是很大的，一般均希望用两种以上的方法来分析蛋白质的纯度。只有一种检定方法时应该用两种以上条件来鉴定。对蛋白质纯度的要求因工作需要而异，生物制品考虑制品体内的副作用，物理化学研究要求不干扰对象的物化性质，化学结构分析要示杂质含量低于分析方法的灵敏度等等均要作具体分析。
确定蛋白质（或多肽）样品的纯度标准大致如下。即分子大小是否均一，电荷 是否均一，是否具有恒定的氨基酸组成，是否具有单一的N 末端和C
末端残基，进一步纯化时生物活性是否再有提高及能否结晶等，从N 末端测顺序一般在4 步以上。如果都是单一的氨基酸残基，则含杂质可能为十六万分之一。
上述几条是较严格的要求，很难全都达到。通常以电泳时呈现一条带以及末端残基鉴定是单一的即可进行顺序测定。
随着分析技术水平的不断提高，经常还将一种曾认为是纯的蛋白质分离成几个组分，即出现微不均一性（Microheterogeneity）的现象。这种不均一性可分为两类情况。一类是在蛋白质肽链合成后在加工中产生的，如糖蛋白由于含糖量不同，它们的电泳行为常表现很大差异，又如赖氨酸的甲基化，丝氨酸的磷酰化以及磺酰化等，也会产生电泳行为的不均一性；还有一些则是在分离纯化过程中人为产生的，如脱酰氨等，这种不均一性对蛋白质顺序分析不会带来太大的困难。另一类不均一性是由于基因家族产生的，它们之间的不同表现为个别氨基酸的替换、N
端或C 端肽段的缺失等，这种不均一性会给蛋白质分析带来很大困难。
但蛋白质分子的一部分分子的一个侧链酰基变成了羧基，糖蛋白的配基相差一个单糖，这种情况下蛋白质化学结构仍是单元一蛋白质，生物功能也无任何影响。此外还有同功蛋白质（Isoprotein），它的功能相同但化学结构不同，从功能上看纯了从结构上看不纯。因此，纯度属相对的概念，具体情况要多做具体分析，切不可简单化。
