蛋白质提取与制备(Protein Extraction and Preparation)-5
确定沉淀蛋白质所需硫酸铵浓度的方法
将少量样品冷却到0～5℃，然后搅拌加入固体硫酸铵粉末，见蛋白质产生沉淀时，离心除去沉淀，分析上清液确定所要蛋白质的浓度，如它仍在溶液中则弃去沉淀，再加更多的硫酸铵于上清液中，直到产生蛋白质沉淀时止。以所要提取的蛋白质在溶液中的浓度对硫酸铵浓度作图，得沉淀曲线，找出蛋白质开始沉淀的浓度。如不考虑收率，饱和度区间可取得窄一
些，使纯度高一些。
盐析时注意的几个问题：
盐的饱和度
不同蛋白质盐析时要求盐的饱和度不同。分离几个混合组成的蛋白质时，盐的饱和度常由稀到浓渐次增加。每出现一种蛋白质沉淀进行离心或过滤分离后，再继续增加盐的饱和度，使第2
种蛋白质沉淀。例如用硫酸铵盐析分离血浆中的蛋白质饱和度达20%时，纤维蛋白原首先析出；饱和增至28～33%时，优球蛋白析出；饱和度再增至
33～50%时，拟球蛋白析出；饱和度大于50%以上时清蛋白析出。用硫酸铵不同饱和度分段盐析法，可从牛胰酸性提取液中分离得到9 种以上蛋白质及酶。
PH 值
pH 值在等电点时蛋白质溶解度最小易沉淀析出。因此盐析时除个别特殊情况外，pH 值常选择在被分离的蛋白质等电点附近。由于硫酸铵有弱酸性，它的饱和溶液的pH 值低于7，如所要蛋白质遇酸易变性则应在适当缓冲液中进行。
蛋白质浓度
在相同盐析条件下蛋白质浓度愈高愈易沉淀。使用盐的饱和度的极限也愈低。如血清球蛋白的浓度从0.5%增至3.0%时,需用中性盐的饱和度的最低极限从
29%递减至24%.某一蛋白质欲进行两次盐析时,第1 次由于浓度较稀,盐析分段范围较宽,第2 次则逐渐变窄.例如胆碱酯酶用硫酸铵盐析进时，第1
次硫酸铵饱和度为35%至60%,第2 次为40%至60%.
蛋白质浓度高些虽然对沉淀有利,但浓度过高也易引起杂蛋白的共沉作用.因此,必须选择适当浓度尽可能避免共沉作用的干扰。
温度
由于浓盐液对蛋白质有一定保护作用，盐析操作一般可在室温下进行。至于某些对热特别敏感的酶，则宜维持低温条件。通常蛋白质盐析时对温度要求不太严格。但在中性盐中结晶纯化时，温度影响则比较明显。
脱盐
蛋白质用盐析法分离沉淀后，常需脱盐才能获得纯品。脱盐方法最常用的是透析法。透析法所需时间较长，常在低温下进行并加入防腐剂避免微生物污染。透析使用前必须处理，方法是将透析袋置于0.5mol/LEDTA
溶液中煮0.5h,弃去溶液,用蒸镏水洗净,置50%甘油中保存备用。也可用分子筛层析，常用SephadexG-25
柱层析法，上样不要超过床体积的20%。
此外，有些金属离子能和蛋白质形成较为专一的结合而使蛋白质沉淀。这虽不是典型的盐析，但在制备蛋白质中有许多成功的例子。锌离子在特定pH 下与胰岛素结合形成沉淀就是这种例子。
蛋白质从悬浮液中沉淀出来的速度极慢，必须用强力离心来促进这个过程。
2、有机溶剂分离纯化法
有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低。有机溶剂与水作用能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。用此法所析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降。分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。操作时的pH
值大多数控制在待沉淀蛋白质等电点附近。有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性和提高分离的效果。一般在有机溶剂沉淀时添加中性盐的浓度在0.05mol
左右,过多不仅耗费有机溶剂,而且可能导致沉淀不好.沉淀的条件一经确定,就必须严格控制,才能得到重复性结果.有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度素示.故操作条件比盐析法严格。
许多有机溶剂，如碳链较长的醇，它溶于水，但有限度。其量大到一定程度后则分成两相，一相以水为主，一相以有机溶剂为主。某些第3 组分的存在可以改变两相的比例和组成。
有许多蛋白质在两相中均能溶解，形成分配。在同一个两相的溶剂系统中，不同的蛋白质有不同的分配系数。根据这一原理，操作全部机械化的有逆流分溶。因要求实验室温度恒定且操作也繁杂，虽一直有人在用但很不普遍。分配层析也是应用这一原理，但在分离纯化蛋白质工作中用得不多，主要是因为多数蛋白质在有机溶剂中，特别是在易与水分相的溶剂中溶解度小且易变性。
疏水层析是近年发展的新方法。它利用蛋白质表面有一部分疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。洗脱时将盐浓度逐渐降低，蛋白质因疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化。此法能分离其它一些方法不易纯化的蛋白质。
利用分子形状和大小不同的分离方法
蛋白质形状有细长的如纤维，有密实的如圆球，形状很不相同。蛋白质的分子量从6000左右开始，有各种大小，大的可以大到几百万。利用这些差别，有几种方法可用来分离蛋白质。
凝胶层析：
属最常用的蛋白质分离方法。系混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。所指凝胶从广义上说是一类具有三维空间多孔网状结构的物质，如天然物质中的马铃薯淀粉及琼脂糖凝胶，人工合成品的葡聚糖凝胶及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等。把适当的凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，于柱内加入欲分离的混合物，然后用大量蒸镏水或其它稀溶液洗柱，由于混合物中各物质的分子大小和形状不同，在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗
粒间的空隙最先流出柱外。分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，致使最后流出柱外。整个过程和过滤相似，故又名凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤等。由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，有人也称之为阻滞扩散层析、排阻层析等。
凝胶过滤是分子筛的一种，在介绍凝胶过滤法之前，首先介绍分子筛的由来。McBain(1928)提出了分子筛的概念。后来发现这一现象在许多地方都存在。Synge
与Tiselins（1950）在解释凝胶层中的电泳和电渗现象时引用了分子筛的概念。此后发现在柱层析中也有这种现象，于是许多工作者尝试了一系列适用于生物高分子分离纯化用的分子筛。至1959年Porath
与Flodim
找到部分水解的葡聚糖凝胶将其交联，得到了商品名为交联葡聚糖（Sephadex)的分子筛。该分子筛具有许多良好的性能，在蛋白质的分离分析中已被广泛采用。
Lathe 与Ruthven(1956)曾利用分子筛效应测定过分子大小与分子量。Flodin
与Granath（1961）发现不同分子量的葡聚糖级分，其凝胶过滤行为与分子量大小有关。Andrew（1962）发现蛋白质中也有类似的性质.此后经过不少人的实际应用，完善了这一方法，形成一个可靠的测定高分子分子量的方法。
凝胶层析是60 年代初发展起来的一种快速而又简便的分离技术。由于设备简单、操作方便和不需要有机溶剂，以及对高分子物质有很高的分离效果，所以目前它已被生物化学、分子生物学、生物工程学及医药学等有关领域广泛应用。
