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蛋白质提取与制备(Protein Extraction and Preparation)-4

2020.9.07

蛋白质提取液中，除包含所需要的蛋白质（或酶）外，还含有其它蛋白质、多糖、脂类、核酸及肽类等杂质。除去的方法有：
1）核酸沉淀法
该法可用核酸沉淀剂和氯化锰、硫酸鱼精蛋白或链霉素等。必要时也可用脱氧核糖核酸酶除去核酸。即在粗匀浆中加入少量DNase,于4℃保温30～60min，可使DNA 降解为足够小的碎片，以致不影响以后的纯化。
2）醋酸铅沉淀法
利用醋酸铅沉淀剂除去杂蛋白。因这些沉淀剂也常常使需要的酶（或蛋白质）缓缓变性而失去活性，所以用这类试剂时应迅速进行盐析，使样品与这类试剂脱离接触。
3）调pH 值或加热沉淀法
利用蛋白质酸碱变性性质的差异除去杂蛋白。利用蛋白质的热变性的温度系数差异，可在一定的PH 下将蛋白提取液加热到一定的温度，使对热不稳定的杂蛋白性沉淀而除去。
4）选择性变性法
利用各种蛋白质稳定性的不同，可用选择性变性法来除去杂蛋白。例如胰蛋白酶及细胞色素C 等少数特别稳定的酶，甚至可用2.5%三氯醋酸处理，此时其它杂蛋白均变性而沉淀，而胰蛋白酶和细胞色素C 则仍留在溶液中。
5）透析法
小分子物质常在整个制备过程中多次液相与固相互转化中被分离，或最后用透析法除去。
1、利用溶解度不同的纯化方法
原理：盐析法对于许多非电解质的分离纯化均适合。对蛋白质和酶的提纯应用也最早。至今还广泛使用，一般粗抽提物经常利用盐析法进行粗分。也有反复用盐析法得到纯的蛋白质的例子。其原理是蛋白质在低盐浓度下的溶解度随盐液浓度升高而增加（盐溶，与离子强度10～1 间成比例增加）。球蛋白当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出（盐析）（离子强度I2～10）。这是由于蛋白质分子内和分子间的电荷的极性基团有静电引力。当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分子一的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。但盐浓度增加一定程度时，水的活度降低，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质相互聚集而沉淀析出。盐析法是根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。盐析时蛋白质的溶解度与溶液中离子强度的关系，可用下式表示：
S
1g-----=-ks×l
So
式中 S0 为蛋白质在纯水（离子强度I=0）中的溶解度，S 为蛋白质在溶液的离子强度为I 时的溶解度，KS 为盐析常数。离子强度可用下式计算。： 1
I=---ΣmiZi2
2
式中mi 为溶液中各种离子摩尔浓度，Zi 为各种离子的价数。①式中当温度一定时，S0 对于某一蛋白质在某溶液中的溶解度是一常数，故（1）式也改定为：
lgS=β-ks×I
式中β=lgS0，也为一常数，β值主要取决于蛋白质性质，其次与溶液的PH 和温度有关。
ks 值主要和盐的性质（包括盐离子价数和平均半径）有关，也与蛋白质结构有关。一般来说，蛋白质在某一盐液中ks 愈大，盐析效果愈好。蛋白质是具有许多亲水基团的偶极离子，常需用要较高的I 值才能从溶液中析出。根据（3）式分离纯化蛋白质，可在一定的PH 和温度下改变盐的I 值，称为“ks 分段盐析法”，提纯前期常应用此法；也可在一定I 值下改变PH 及温度，称为“β分段盐析法”，常用于提纯后期，特别是使某些蛋白质结晶析出时。
盐的选择：
如上所述，蛋白质在水中溶解度取决于蛋白质分子上离子基团周围的水分子数目，即取决于蛋白质的水合程度。因此，控制水合程度，也就是控制蛋白质的溶解度。控制方法最常用的是加入中性盐。主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最广的是硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25℃时饱满和溶解度为4.1mol,即767g/l;0℃时饱满和溶解度为3.9mol,即676g/l）。在这一溶解度范围内，许多蛋白质均可盐析出来，且硫酸铵价廉易得，分段效果较其它盐好，不易引起蛋白质变性。应用硫酸铵时对蛋白氮的测定有干扰，另外缓冲能力较差，故有时也应用硫酸钠，如盐析免疫球蛋白，用硫酸钠的效果也不错，硫酸钠的缺点是30℃以下溶解度太低。其它的中性盐如磷酸钠的盐析作用比硫酸铵好，但也由于溶解度太低，受温度影响大，故应用不广。氯化钠的溶解度不如硫酸铵，但在不同温度下它的溶解度变化不大，这是方便之处。它也是便宜不易纯化的试剂。硫酸铵浓溶液的PH 常在4.5～5.5 之间,市售的硫酸铵还常含有少量游离硫酸,PH 值往往降至
4.5 以下,当用其他PH 值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节.
硫酸铵饱和度计算及加入方式
在分段盐析时，加盐浓度一般以饱和度表示，饱和溶液的饱和度为100%。用硫酸铵盐析时其溶液饱和度调整方法有3 种。一种是当蛋白质溶液体积不大所需调整的浓度不高时，加入饱和硫酸铵溶液。配制法是加入过量的硫酸铵，热至50～60℃保温数分钟，趁热滤去沉淀，再生 0℃或25℃下平衡1～2 天，有固体析出时即达100%饱和度。盐析所需饱和度
可按下式计算：
S2 - S1
V=V0--------------
1 - S2
式中V 及V0 分别代表所需饱和硫酸铵溶液及原溶液体积，S2 和S1 分别代表所需达到的和原溶液的饱和度。严格来说，混合不同体积的溶液时，总体积会发生变化使上式造成误差，但这由体积改变所造成的误差一般小于2%，可忽略不计。另一种是所需达到饱和度较高而溶液的体积又不再过分增大时，可直接加固体硫酸铵，其加入量可按下式计算：
G（S2 - S1）
X = ----------------
1-AS2
式中X 是将1I 饱和度为S1 的溶液提高到饱和度为S2 时所需硫酸铵的重量（g），G 及A 为常数，与温度有关。G 在0℃时为707，20℃时为756，A 在0℃时为0.27，20℃时为0.29。
在室温及0℃时所需硫酸铵饱和度可查表。第3 种调整饱和度的方法是将盐析的样品液装于透析袋内对饱和硫酸铵进行透析，此法浓度变化较连续，不会出现盐的局部过高现象，但盐析时测定盐的饱和度手续较繁，运用较少。

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周锦帆