应用多重PCR方法鉴定RHD基因型的研究
作者：徐华1，叶世辉1，王宝燕2，刘孟黎1，吴大洲1，贺晨1 作者单位：(1. 陕西省血液中心血型研究室，陕西西安710061;2. 西安交通大学医学院第一附属医院输血科，陕西西安710061)
【摘要】 目的建立一种可靠的PCR方法，用于RHD血型基因型的研究。方法根据RHD血型基因的特点，设计针对不同RHD基因型的特异性引物，建立多重PCR方法，并与商用试剂盒进行对比。结果本研究所建立的用于鉴定RHD血型基因型的多重PCR方法，与商用试剂盒具有相同的试验结果。结论本研究建立的多重PCR方法具有简便、准确和经济的特点，可以用于RHD基因分型。
【关键词】 多重PCR;RHD血型基因型;RHD基因分型;DEL血型
ABSTRACT: ObjectiveTo establish a reliable PCR method for RHD genotypes research.MethodsBased on the characteristics of RHD gene, the specific primers were designed for different RHD genotypes to establish the multiplex PCR and compare it with commercially supplied RHD genotyping kit. ResultsThe multiplex PCR utilized for RHD genotypes was established. The results of RHD genotypes were the same between the multiplex PCR method and commercially supplied kit.ConclusionThe method of the multiplex PCR can be utilized for the study of RHD genotypes because it is convenient, accurate and economical.
KEY WORDS: multiplex PCR; RHD genotype; RHD genotyping; DEL blood group
近年来，研究发现一些血清学初检RHD阴性的个体经过进一步的检验，可以检出D抗原和D基因。通过进一步的研究，又可以分为部分D(partrial-D)和弱表现型D(weak-D)两种类型;这些特殊RHD血型的发现，对更加科学地指导安全输血工作和新生儿溶血病的实验诊断，都有非常重要的意义[1]。目前， RHD血型的鉴定主要依赖于血清学实验。但是，血清学的方法很难检出一些特殊的RHD血型;应用分子生物学的方法鉴定RHD血型具有鉴定准确，可以发现一些特殊的RHD血型，但市售RHD基因分型试剂盒存在价格昂贵、操作复杂等缺点。为了提供一种经济、简便和直观的分子生物学方法，我们开展了多重PCR方法鉴定RHD血型基因型的研究。
1材料与方法
1.1材料DNA标本取自西安市无偿献血者EDTA抗凝全血样本，经血检科初步筛选分为RhD阳性和RhD阴性，用Promega全血DNA提取试剂盒提取基因组DNA，DNA浓度为50～150mg/L，-20℃冻存备用;标准质控对照为德国INNO-TRAIN公司出品，分别为D/d型和d/d型样本。
1.2多重PCR的引物设计多重PCR引物是利用人类不同的RHD基因型的特异性序列位点的改变，设计多对引物，其中引物对①的
DEL-f1和DEL-r1分别为特异性扩增位于第9外显子的DEL基因的上下游引物，DEL-f1最末碱基针对DEL血型1227位发生G>A的突变而设计[2-3]，DEL-r1位于第9、10外显子之间的内含子中，扩增片断长度为102bp;引物对②的Dc-f1和Dc-r1分别为扩增位于RHD和RHCE基因第8外显子的上下游引物，作为内对照使用，扩增片断长度为206bp;引物对③的RhD-f1和RhD-r1分别为特异性扩增位于第10外显子的RHD基因的上下游引物，其中RhD-f1位于第9、10外显子之间的内含子中，无序列特异性，RhD-r1位于RHD基因第10外显子中，与同位置RHCE基因有11个碱基差异，具有序列特异性，扩增片断长度为261bp;引物对④的Dneg-f1和Dneg-r1分别为特异性扩增杂合的Rh盒子基因的上下游引物，其中Dneg-f1位于上游Rh盒子基因内，在下游Rh盒子基因无相同序列，Dneg-r1位于下游Rh盒子基因内，在上游Rh盒子基因无相同序列，扩增片断长度为1921bp(图1、表1)。图1RHD基因型检测引物设计原理图Fig.1 The principle of primer designing for RHD genotyping表1RHD基因型检测引物序列
1.3PCR反应条件PCR仪为PE 9700(美国，AB公司);Taq酶购自上海PROMEGA公司;dNTP购自北京鼎国生物技术有限公司;在100μL的Ependoff管内加入12.8μL PCR缓冲液、2.0μL引物混合物、2.0μL dNTP混合物、0.2μL Taq DNA聚合酶和3.0μL模板DNA，总体系为20μL，充分混合;PCR反应条件为：94℃变性5min，然后进行35个循环的PCR反应(94℃ 40s，56℃ 40s和72℃ 2min)，随后72℃延伸5min，4℃保存;40g/L琼脂糖凝胶电泳(200V，20min)，紫外灯下观察结果并拍照。
1.4验证本方法的准确性对照的RHD基因检测试剂盒分别购自德国INNO-TRAIN公司和天津市秀鹏生物技术开发有限公司，按照试剂盒的实验方法进行操作，以结果的格局图来判断结果。
