多重PCR反应的方法
一)选择目标基因
由于多重PCR在同一个反应体系中需要加入多对引物,而模板直接影响扩增的结果分析,这就导致了扩增模板的选择至关重要。同时,扩增区域的选择必须符合分析的目的,如通常对于致病微生物,需要选择其保守序列,如16sRNA,或者毒力基因、毒力相关基因,以防止检测到非致病突变体而无法解释结果;对于需要分型的对象来说,需要选择它们之间有差异的保守序列进行扩增;对于高度同源的序列来说,可以用相同的引物进行扩增,但获得的阳性结果需要利用特异探针杂交或限制性酶切进行进一步确定;缺失分析选择扩增外显子;法医学鉴定个体差异选择扩增高度多态性标志;转基因检测则选择转入的动植物基因座;性别鉴定一般选择X或Y性染色体上特有的基因座 对于含有多个外显子的基因缺失分析来说,可选择缺失热点较广区域或缺失密集区域。相邻近的外显子可用跨越这两个外显子的引物进行扩增。
二)引物设计引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸序列,使其能有效地扩增模板DNA序列。因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与灵敏度。要确定引物的位置,首先需要知道所选择的基因引物与模板结合部位的详细DNA序列信息。在多重PCR中,为了保证扩增效率,所有的引物对必须优化到相近的扩增条件。
因此,多重PCR的引物设计除了要满足一般PCR引物设计的原则外,还要注意以下几个问题:
①各引物之间不能互补,尤其避免3的互补,以免形成二聚体,引物设计好以后进行PCR扩增,以检验引物之间是否配对形成二聚体;
②各引物与其它扩增片段和模板不能存在较大的互补性,扩增片段之间也不能有较大的同源性;
③对于引物的长 度、(G+C)含量、T值要求尽量一致;
④各引物扩增产物的片段大小要有一定的差别,以便于用电泳的方法进行区分。
一般来说,产物片段越大,其长度的差别也应该越大。这就给多重PCR引物的设计带来了一定的难度。
三)核酸提取核酸依赖的检测方法受目标核酸纯化的影响,核酸的纯化程度决定了核酸方法的应用。
多重PCR的优势在于快速、系统,主要用于临床标本的检测,包括血液、组织、粪便等,同时多重PR对核酸模板的要求比较高,所以核酸的提取纯化显得尤为重要,直接与扩增结果 一般来说,通过煮沸裂解细菌制备模板可以满足普通PCR反应,但是用于多重PCR反应会存在很多问题。在条件允许的情况下,多重PCR需要以纯化的DNA为模板,可以确保多重PCR的顺利进行。
四)单位点PCR(也叫单引物PCR)在进行多重PCR之前,必须先对每对引物进行单位点PCR。确定每对引物进行单位点PCR时条件如表1所列
反应完成后比较扩增结果,确保在相同的循环条件下所有的引物都能扩增出对应的产物条带,以确保引物能够特异性扩增对应的目标序列。
五)多重PCR(引物等浓度混合)反应体系中各对引物等浓度混合,体系中其它各成分的浓度不变,应用与单位点PCR相同的反应条件进行多位点同时扩增,根据扩增结果对多重PCR反应体系及反应条件进行调整,具体操作如下面所述。
六)优化多重PCR反应体系及反应条件多重PCR的反应体系和反应条件基本与单位点PCR相同,但也不能一蹴而就,必须使多重PCR反应中每对引物对应的靶点都能获得足够的扩增量,并且扩增产物之间的产量应该基本影响多重PCR扩增效果的因素可以分为反应体系和反应条件两大类。其中反应体系包括引物、缓冲液、 Taq DNA聚合酶、dNTP和MgCl2等,反应条件包括退火温度、延伸温度、延伸时间,循环数等
