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circRNA_104075在促进肝癌发生和进展的机制研究

2020.9.05

　　在全球范围内原发性肝癌是造成癌症相关死亡的三大原因之一。肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝脏癌症。由于缺乏高特异性和敏感性的早期诊断生物标志物，HCC患者往往得不到及时有效的治疗。相比于长链非编码RNA和miRNA，circRNA作为一种新型环状RNA，具有共价闭合环状结构，在组织和血液中具有高度稳定表达和存在的特点。并且已有研究证明circRNA在多种疾病发生发展中起到关键的调控作用，且可以作为高特异性和敏感性的生物标志物应用于早期的临床诊断中，具有很好的应用前景。此外，m6A RNA甲基化修饰是哺乳动物中最丰富的RNA修饰类型。它在RNA的表观遗传调控中发挥着多种作用，包括mRNA的稳定性、选择性剪接和miRNA的成熟过程。m6A修饰还可以调节甲基化转录本的结构，阻止或诱导其他RNA的结合。

　　近日，上海交通大学附属胸科医院于永春的团队研究揭示了在HCC细胞系中高表达的circRNA_104075，其表达受HNF4a调控，circRNA_104075海绵吸附靶向抑制YAP表达的miR-582-3p，促进肝癌的发生和进展，也揭示了circ_104075在诊断HCC方面具有高达96%的敏感性和98.3%的特异性，具有作为诊断HCC的生物标志物的潜能。该研究成果以“circRNA_104075 stimulates YAP-dependent tumorigenesis through the regulation of HNF4a and may serve as a diagnostic marker in hepatocellular carcinoma”为题发表在Nature子刊《Cell Death & Disease》(IF 6.218)。

　　文章内容：

　　1. circ_104075在HCC组织中高表达

　　该团队首先对先前已经报道过的三个HCC组织中circRNA表达数据(云序生物提供环状RNA测序服务)进行合并分析，筛选到了一个高表达的环状RNA分子，即circ_104075。并且与正常的癌旁组织相比，HCC中circ_104075明显高表达。同时与其他先前研究报道过的HCC血清诊断标志物（DANCR, HULC, UCA1, miR-21 和 miR-223）相比，HCC患者中circ_104075表达上调的水平更显著。

　　图1. 肝癌患者circ_104075表达上调

　　2. HCC中circ_104075表达受HNF4a正调控

　　作者选择了一些公认的HCC致癌的转录因子，通过敲除和过表达发现在这些转录因子中只有HNF4a的表达与circ_104075的表达正相关。相比于正常小鼠，HNF4a敲除小鼠肝的大小和重量明显减少，同时circ_104075的表达也明显降低；临床HCC组织分析发现HCC患者中HNF4a的表达水平也是明显上调，进一步证实了HNF4a的表达与circ_104075的表达成正相关的结论。

　　图2. circ_104075表达受HNF4a正向调控

　　3. HNF4a是如何调控circ_104075的表达的？

　　为了验证转录因子HNF4a是如何调控circ_104075表达的，作者通过预测发现HNF4a可以结合circ_104075启动子（-1482 to -1296）的位点；接着利用ChIP-qPCR（云序生物提供此项实验）捕获HNF4a沉淀复合物后，在HCC组织和HCC细胞系中都发现了HNF4a可以结合circ_104075启动子（-1482 to -1296）的位点；荧光素酶报告基因实验也证实了过表达HNF4a可以明显促进circ_104075启动子的荧光素酶活性，而敲低HNF4a表达抑制circ_104075启动子的荧光素酶活性；如果突变circ_104075启动子上HNF4a结合位点，过表达或者敲低HNF4a表达则对其荧光素酶活性无明显影响，揭示HNF4a通过结合circ_104075启动子，正向调控其表达。

　　图3. HNF4a结合circ_104075的启动子

　　4. circ_104075促进YAP（致癌信号通路）的表达

　　接下来，作者探究了circ_104075在HCC中可以调控哪些致癌信号通路。通过敲除和过表达circ_104075后发现，只有YAP所涉及的相关促进HCC的信号通路的改变，YAP与circ_104075的表达呈正相关，并且YAP是公认的HCC促进因子。临床验证也同样揭示了YAP的表达与circ_104075的表达呈正相关的结论。

　　图4. circ_104075正调控YAP表达

　　5. circ_104075可以结合miR-582-3p

　　作者首先想到circRNA通过海绵作用吸附miRNA，直接调控靶蛋白的表达，作者利用miRanda数据库预测了circ_104075最有可能结合的5个miRNA，接着通过RNA pull down技术（云序生物提供此项实验）捕获复合物后RT-qPCR检测发现只有miR-582-3p存在结合；通过构建突变形式circ_104075和miR-582-3p，荧光素酶报告基因实验证实了WT circ_104075和WT miR-582-3p的结合，WT miR-582-3p可以抑制WT-、Mut1-和Mut2 -circ_104075的酶活性，而抑制不了Mut3 circ_104075的酶活性，提示circ_104075该结合位点的5’和3’端序列对于miR-582-3p的结合至关重要。同时Mut miR-582-3p则无法抑制circ_104075的酶活性。

　　图5. circ_104075直接结合miR-582-3p

　　6. miR-582-3p可以靶向结合YAP-3’UTR

　　已经证实了circ_104075可以结合miR-582-3p，同时circ_104075与YAP表达成正相关，那么问题来了，miR-582-3p是否靶向调控YAP表达呢？进一步研究证实了miR-582-3p表达与YAP表达的负相关性，通过预测发现miR-582-3p的5’端可以结合YAP mRNA 的3’UTR的三个位点，对这三个位点进行突变后进行荧光素酶报告基因实验，发现miR-582-3p无法抑制Mut1-YAP-3’UTR，说明YAP mRNA 的3’UTR（315-321碱基序列）对于miR-582-3p的5’端的结合很重要；通过敲低circ_104075后抑制miR-582-3p，证明了miR-582-3p在circ_104075促进YAP表达过程中发挥着重要作用。

　　图6. YAP-3’UTR是miR-582-3p的靶点

　　7. YAP-3’UTR的m6A修饰水平促进miR-582-3p的结合

　　通过MeRIP-qPCR（云序生物提供此项实验）检测到了P1-YAP-3’UTR (235-419 碱基序列)的表达上调，而该区域对于miR-582-3p的结合也很重要。YAP-3’UTR （235-419区域）中的353-357区域存在m6A motif（RRACU）——AGACU，通过突变这位点碱基后过表达进行MeRIP-qPCR，发现只有不突变最后三个碱基ACU的YAP-3’UTR的m6A修饰水平不会降低。同时荧光素酶报告基因实验也证实了YAP-3’UTR 353-357区域的AGACU对于miR-582-3p结合后发挥抑制功能来说是至关重要的。临床组织样本的MeRIP-qPCR也证实了HCC患者组织的YAP-3’UTR 353-357区域的m6A修饰水平明显降低，与HCC患者的YAP表达上调存在一致性。

　　图7. YAP-3’UTR中的m6A修饰促进了其与miR-582-3p的相互作用

　　8. circ_104075在HCC中的临床诊断意义

　　通过对一系列消化系统疾病的分析发现，相对于其他消化系统癌症， circ_104075在HCC患者血清中高表达是具有特异性的，并且随着HCC的进展呈现正相关性，同时手术治疗后HCC患者血清中的circ_104075表达水平明显降低；ROC曲线分析发现，相对于HCC中其他一些应用的生物标志物来说，血清circ_104075表达水平具有更高的敏感性和特异性，提示其可作为诊断HCC的生物标志物从而应用于临床中(云序生物提供环状RNA实时定量PCR服务)。

　　图8. 血清circ_104075可作为HCC诊断的生物标志物

　　综上所述，该研究阐明了circ_104075在HCC中上调的机制以及其下游调控HCC肿瘤发生的机制。并且揭示circ_104075可以作为一种新的肝癌诊断生物标志物和治疗靶点。

　　全文链接

　　https://www.nature.com/articles/s41419-018-1132-6

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