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人源抗体开发——B细胞永生化（二）

2021.6.29

2.3 遗传修饰以促进抗凋亡因子表达

原癌基因BCL-6属于抗细胞凋亡家族，具有转录抑制功能，可促进B细胞增殖，同时抑制B细胞向浆细胞分化，BCL-xL作为BCL-2家族成员蛋白，通过与促凋亡蛋白的拮抗作用从而抑制细胞凋亡。Kwakkenbos等利用逆转录病毒转导系统将BCL-6和BCL-xL基因导入从人外周血单个核细胞 (Peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)分选的CD27⁺记忆B细胞中，创建了B细胞永生化平台——AIMSelect，并成功进行了多个物种B细胞永生化。类似地，Caeser等发现BCL-2与MYC或BCL-6共转导可使GCB细胞长期扩增和存活。FOXP1可直接抑制各种促凋亡基因的转录，并与CD40和NF-κB信号传导合作，通过抑制caspase依赖性凋亡来促进B细胞扩增，FOXP1还可部分通过控制BCL-xL表达介导成熟B细胞存活。此外，miRNAs介导的细胞转化也可能实现B细胞永生化，某些宿主和病毒编码的人类miRNA直系同源基因控制着B细胞的细胞生长和存活，这类新发现的刺激B细胞生长的miRNA可在不久的将来作为永生的手段进行尝试。

通过遗传修饰的方式可促进某些抗凋亡因子的表达从而获得永生化B细胞，但是这种方法制备抗体的效率低，主要是因为B细胞是一种难转导的原代细胞，在为数不多的永生化B细胞中，最终获得阳性克隆的数量极少。

2.4 体外诱导B 细胞自发永生化转化

CD40-CD40L是特异性免疫反应中重要的共刺激分子，其在调节初级和/或次级体液免疫反应后的B淋巴细胞活化中起作用。通过向生长培养基中添加CD40L和细胞因子，可以促进B细胞存活和增殖，延长体外培养的时间。Banchereau等首次证明CD40与IL-4的交联可诱导人B淋巴细胞进入有限的增殖状态，以这种方式获得的长寿命B淋巴细胞可以分泌IgG、IgM和IgA。

CD40L-CD40 为体内特异性免疫反应系统重要的一对共刺激分子,参与机体的体液免疫和细胞免疫反应。在B 细胞的活化与增殖分化、抗体产生及同种类型转换中起关键作用,在T 细胞活化以及效应性细胞因子的分泌过程中也起重要调节作用。

CD40为CD40L的受体, 是相对分子质量(Mr)为48 000 的Ⅰ型膜糖蛋白, 属于神经生长因子受体(NGFR)/ 肿瘤坏死因子受体超家族成员。CD40 主要表达在B 细胞、胸腺上皮细胞、活化的单核/巨噬细胞、树突状细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞及一些肿瘤细胞(如肝癌细胞系HepG2、S 黑色素瘤细胞系Hs294T)等。豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)、抗IgM 抗体、抗CD20 抗体以及IFN-γ均可刺激细胞表达CD40 , IFN-γ还可刺激肿瘤细胞表达CD40。

CD40L 表达谱广泛, 主要表达在CD4 +T 细胞表面, 包括Th0、Th1 及Th2 细胞亚群。近来研究表明, CD40L 也表达在其他T 细胞表面, 如CD8 +或CD45RO +/ CD45RA +T 细胞、Tc1/Tc2 细胞或B 细胞表面。实验表明, 功能性的CD40L 也表达在造血系中非淋巴细胞, 如嗜碱/ 嗜酸性粒细胞、单核/ 巨噬细胞、Kupffer 细胞、Nk 细胞以及血小板细胞的表面。非造血系细胞, 如肥大细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、树突状细胞以及上皮细胞表面都有表达。但这些细胞表达CD40L 是有差异的。活化的T 细胞可瞬时表达CD40L(活化后5 ～ 10 min), 在6 h 时达到顶峰, 随后的12～ 18 h 表达量开始下降。其他细胞也可诱导性的表达, 但诱导后可持续性表达, 也有的细胞为组成性表达。诱导物一般有PHA、ConA 及细胞因子如IL-1、TNF-α和一些抗CD2、抗CD3、抗CD28 的单克隆抗体(mAb)。近来研究表明, TGF-β 可增强CD154 在人T 细胞表面的表达。IFN-γ及IL-4 诱导淋巴细胞表达CD40L 的观点一直没有确认, 但CD40L 与CD40 结合后, CD40L 的表达量却可升高,提示可能存在着旁分泌的反馈环。

从CD40L 基因表达的机制来讲, 蛋白激酶C(PKC)、钙调磷酸酶(calcinerurin)以及穿膜的钙浓度的增加均可提高CD40L的表达量。研究表明, T 细胞中CD40L 基因表达需要钙依赖的转录因子-T 细胞活化核转录因子(NF-AT)。钙可能是协同加强钙/钙调素依赖的激酶Ⅳ来上调CD40L 启动子的活性,后者包含4 个NF-AT 的结合位点。启动子的活性可被环孢霉素A 抑制, 这可能是通过钙调磷酸酶来阻止NF-AT 的胞液氨基肽酶的转录而实现的。

人CD40其前体含有297 个氨基酸, N 端为20 个氨基酸的信号肽, 胞膜外区有193 个氨基酸,跨膜区有22 个氨基酸, 胞浆区由62 个氨基酸残基组成。胞膜外区共有4 个富含半胱氨酸的结构域(CRD), 在其铰链区的71 个氨基酸中, 有9 个丝氨酸和7 个苏氨酸, 是潜在的o-糖基化位点。CD40 的糖基化程度较高, 根据氨基酸推算其Mr 为28 000, 糖基化后的Mr 为40 000～ 50 000。

CD40L 基因编码261个氨基酸, 其中膜外C-端富含半胱氨酸, 跨膜区含有24 个氨基酸, 膜内的N-端含有22 个氨基酸, 膜内端缺失信号肽。CD40L 分子共有3 种存在形式:即31 kD、18 kD 和14 kD。晶体衍射分析证明, 可溶性膜外端以三聚体的形式存在。现已证实, 三聚体结构是其发挥功能的前提条件, 引入亮氨酸拉链基序(motif)可显著提高可溶性CD40L 的生物学活性。近来研究证实,CD40L 信号是通过募集胞浆的CD40 形成三聚体, 通过与TNF受体相关因子(TRAF)结合而进行信号转导。

CD40 可通过活化NF-κB/ Rel 来诱导胚系R1 的转录, 起到IgG 同种异型的转换。
CD40L-CD40 结合后, 可诱导内源性TGF-β 及IL-10 表达, 促成VHDJH-Ca1 和VHDJH-Ca2 的转录及IgA 的分泌, 在IL-4 的存在下, CD40L 可诱导IgE 转录及表达。
通过CD40传导信号活化的NF-κB 可激活磷酸络氨酸激酶(PTK)和丝氨酸/素氨酸激酶, 这在CD40介导的B细胞活化中很关键.

CD40L 与CD40 作用后的功能如下:

(1)挽救B细胞避免Fas(CD95)或抗原诱导的IgM交联引起的凋亡;

(2)上调活化T细胞表面共刺激分子B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的表达量;

(3)增加其他细胞表面CD23、CD54 、CD95 以及LT-β 的表达;

(4)诱导免疫球蛋白的同种型转换;

(5)诱导B细胞进行阴性选择。

随着B细胞离体培养技术研究的不断深入，不依赖病毒感染和遗传修饰的体外培养诱导B细胞永生化已成为可能。Wiesner等提出了一种体外诱导人B细胞永生化的方法。在环孢素A和IL-4的存在下，PBMC与过表达人CD40L的饲养细胞共同培养，获得永生化的B细胞，成功观察了1650d，且B细胞具有恒定的表型，随着时间的推移稳定或增加了其端粒长度。Neron等也基于CD40-CD40L相互作用模型，外源添加多种细胞因子，在大约50d内，从PBMC中分选的IgG+和IgA+记忆B细胞发生了1×10⁶倍扩增，并可用于人多克隆IgG生产。Haniuda等提出了体外诱导小鼠生发中心B细胞培养系统，该系统可诱导幼稚B细胞大规模扩增，成为具有生发中心B细胞样表型的细胞(iGB)，且不同细胞因子的活化刺激作用可决定iGB细胞的发育命运，外源添加IL-4可使其发育为记忆B细胞，外源添加IL-21则引导其发育为长寿命浆细胞，这为人类B细胞的体外长期培养提供了借鉴意义。

不依赖病毒感染或者遗传修饰的B细胞体外诱导培养操作也可以使B 细胞永生化或者近永生化，具有制备HuMAb的应用潜力。但是通过体外刺激培养诱导B 细胞自发进行永生化转化，涉及到CD40L和多种细胞因子的协调作用，而相关作用机制尚不明朗，在初始B细胞种类的选择和培养条件中各组分的形式 (可溶性、膜结合型等)、添加量、添加时机等方面还需要进行更深度的探索。

以CD40L为例，已有研究表明，不同形式的CD40L的生物学活性有差异，总体来说，CD40L单克隆抗体＜可溶性CD40L重组蛋白＜膜结合型CD40L，其中，随着稳定多聚体的增加，可溶性重组CD40L蛋白的生物学活性也相应提高。但目前多数研究仍旧采用表达CD40L的饲养细胞进行B细胞离体培养。

实验室研究发现，传统的B细胞体外培养条件中，经X射线辐照饲养细胞层后饲养细胞的状态存在不稳定性，对B细胞的离体培养造成明显影响，辐照强度不足时饲养细胞会与B细胞竞争营养，饲养细胞代谢产物可能影响B细胞生长，而辐照过度则会失去维持B细胞生长的效果，因此，实验室致力于寻找一种膜结合型CD40L展示方法以期替代饲养细胞在B细胞培养中的功能。已有研究利用细胞膜囊泡展示功能性蛋白，受到这些研究的启发，目前实验室已构建完成人CD40L囊泡，其可通过外源添加的方式取代饲养细胞支持B细胞体外培养，同时通过优化及固定制备方案、使用分析型流式细胞仪并加入流式计数荧光微球对囊泡进行绝对计数以确定添加量等方式，解决了先前存在的培养条件不稳定的问题(图2)。

直接从分泌天然抗体的人B细胞中获得HuMAb，是理论上简单有效但技术上存在困难的方法，因为B细胞在体外培养的寿命有限，且无法无限增殖，在细胞数量和抗体分泌量极少的情况下，难以检测和分离获得抗原特异性B细胞，而B细胞永生化则从根本上解决了细胞丰度低的问题，为后续鉴定和分离操作提供了有利条件。

基于B细胞永生化技术的抗体研发平台可以在难以获得免疫原和未获得抗体时进行功能性鉴定和筛选，目的明确、工作量更小、筛选周期短，其在疾病的治疗、预防及体内诊断方面具有良好的应用潜力，特别是肿瘤、慢性病和未知传染性疾病。基于B细胞永生化技术制备HuMAb虽有若干种方法，但仍停留在实验室研究阶段(表2)。理想的B细胞永生化技术应该具备高永生化效率和高筛选效率两个重要特征。已经有研究表明，人B细胞可以仅通过外部刺激的方式自发进行永生转化，这种方式不依赖癌病毒感染和基因操纵，在操作简便性和安全性方面都更具优势。而微流控平台、单细胞分析、荧光光谱法、细胞表面荧光免疫吸附测定等先进技术的涌入、发展和联合为分离抗原特异性B细胞提供了更高效的方法。

随着B细胞永生化研究的不断深入和技术的不断成熟，分泌天然人抗的永生化B细胞将进一步为制备HuMAb奠定基础，使其在生物医药研究和临床应用中发挥更广泛的作用。

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