DNA测序技术-自动测序法介绍
自动测序法
基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司ZL的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。
由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。
一、准备工作
1. BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix，内含PEZL四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。
2. pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2 g/L，试剂盒配套试剂。
3. M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl，试剂盒配套试剂。
4. DNA测序模板 可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1 μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2 g/L，即200 ng/μl。
5. 引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。
6. 灭菌去离子水或三蒸水。
7. 0.2 ml或和0.5 ml的PCR管 盖体分离。
8. 3 mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8 g NaAc·3H2O溶于70 ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100 ml，高压灭菌后分装。
9. 70%乙醇和无水乙醇。
10. NaAc/乙醇混合液 取37.5 ml无水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。
11. POP 6测序胶 。
12. 模板抑制试剂(TSR) 。
13. 10×电泳缓冲液 。
14. 全自动DNA测序仪。
15. PCR仪。
16. 台式冷冻高速离心机。
17. 台式高速离心机或袖珍离心机。
二、PCR测序反应
1. 取0.2 ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：
所加试剂 测定模板管 标准对照管
BigDye Mix 1 μl 1 μl
待测的质粒DNA 1 μl －
pGEM-3Zf (+) 双链DNA － 1 μl
待测DNA的正向引物 1 μl －
M13(-21)引物 － 1 μl
灭菌去离子水 2 μl 2 μl
总反应体积5 μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。
2. 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2 min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃4 min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。
三、醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物
1. 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5 ml EP管中。
2. 加入25 μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10 min以沉淀DNA。12 000 r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。
3. 加70%(V/V)的乙醇50 μl洗涤沉淀2次。12 000 r/min于4℃离心5 min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15 min。
四、电泳前测序PCR产物的处理
1. 加入12 μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。
2. 将溶液转移至盖体分离的0.2 ml PCR管中，稍离心。
3. 在PCR仪上进行热变性(95℃ 2 min)，冰中骤冷，待上机。
五、上机操作
1. 按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。
2. 仪器将自动灌胶至毛细管，1.2 kV预电泳5 min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2 kV，20 min)，在7.5 kV下电泳2 h。
3. 电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。
4. 每一个样品电泳总时间为2.5 h。
5. 电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。
六、序列分析
仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。
七、仪器清洗
测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
八、计算
1. 测序反应精确度计算公式：100%－差异碱基数(不包括N数)/650×100%。
2. 差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基，N为仪器不能辨读的碱基。
