深加工产品 DNA提取方法及GMO食品的转基因PCR检测（二）
2 . 大豆色拉油DNA提取操作程序
取 20ml 精炼大豆色拉油加入 20ml Buffer Ⅰ，磁力搅拌器充分混匀， 2 小时；
加入 40ml Buffer Ⅱ，磁力搅拌器充分混匀， 2-3 小时；
4 ℃， 12,000rpm 离心 20 分钟，小心移去油相；
加入等体积 Buffer Ⅲ与 4 μl Buffer Ⅳ，混匀，常温放置 10 分钟后， 12,000rpm 离心 20 分钟，弃上清，保留沉淀；
加入 1 ml Elution Buffer 溶解沉淀，加入 1ml 异丙醇，混匀，常温放置 10 分钟后， 12,000rpm 离心 20 分钟，弃上清，保留沉淀；
在沉淀中加入 100 μl Elution Buffer, 于 37 ℃充分溶解沉淀， 5 分钟后加 300 μl Buffer Ⅴ，上下颠倒 10 次，充分混匀；
取出离心柱，将离心柱放置在一个 2ml 的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置 2 分钟；
将离心柱和 2ml 套管一起用 8,000rpm 离心 30 秒，弃去 2ml 套管中的溶液，在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
12,000rpm 离心 30 秒，去除离心柱中痕量残余溶液；
将离心柱放置在一个新的 1.5ml 离心管中（离心管请自备），在离心柱底部中央小心加入 50 μl Elution Buffer, 于 Buffer ， 37 ℃放置 2 分钟后， 12,000rpm 离心 30 秒；若需提高得率，可在在离心柱底部中央小心加入 50 μl Elution Buffer, 于 Buffer ， 37 ℃放置 2 分钟后， 12,000rpm 离心 30 秒；
离心管中的溶液即可作为 PCR 反应的摸板。建议一个 PCR 反应使用 0.5 μl DNA, 其余样品在 -20 ℃保存备用。
腐乳DNA提取操作程序
取一块腐乳放在研钵中，加入液氮将样品研磨成粉末，将磨碎样品转入 50ml 的离心管中；
加入 15mlExtraction Buffer Ⅰ，充分混匀；
20 ℃， 12,000rpm 离心 5 分钟；
去掉上清，加入 10ml Buffer Ⅱ和 4ml Buffer Ⅲ，充分混匀；
65 ℃水浴保温 15 分钟
20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，吸取上清到另一新的离心管中；
加入等体积氯仿，轻轻混匀；
20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，吸取上清到另一新的离心管中；
加入等体积异丙醇（自备），混匀；
10) 常温放置 10 分钟后， 20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，弃上清，保留沉淀；
11) 在沉淀中加入 100 μl Elution Buffer, 于 37 ℃充分溶解沉淀， 5 分钟后加 300 μl Buffer Ⅳ，上下颠倒 10 次，充分混匀；
12 ）将离心柱放置在一个 2ml 的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置 2 分钟；
13 ）将离心柱和 2ml 套管一起用 8,000rpm 离心 30 秒，弃去 2ml 套管中的溶液，在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
14 ）在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
15 ）在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
16 ）在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液； 17 ） 12,000rpm 离心 30 秒，去除离心柱中痕量残余溶液；
18 ）将离心柱放置在一个新的 1.5ml 离心管中（离心管请自备），在离心柱底部中央小心加入 50 μl Elution Buffer, 于 Buffer ， 37 ℃放置 2 分钟后， 12,000rpm 离心 30 秒；
19 ）离心管中的溶液即可作为 PCR 反应的摸板。建议一个 PCR 反应使用 0.5 μl DNA, 其余样品在 -20 ℃保存备用。
酱油DNA提取操作程序
取一块腐乳加入 63ml Buffer Ⅰ，充分混匀于 250ml 的离心管中；
-20 ℃下静置 10 分钟；
4 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，；
加入 15ml Buffer Ⅱ，磁力搅拌器充分混匀， 2-3 小时；
吸取溶液与 50ml 的离心管中， 20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，弃上清；
加入 10ml Buffer Ⅲ和 4ml Buffer Ⅳ重新悬浮；
65 ℃水浴保温 30 分钟
20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，吸取上清到另一新的离心管中；
加入等体积氯仿，轻轻混匀；
10) 0 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，吸取上清到另一新的离心管中；
11) 加入等体积氯仿，轻轻混匀；
12) 常温放置 10 分钟后， 20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，弃上清，保留沉淀；
13) 在沉淀中加入 100 μl Elution Buffer, 于 37 ℃充分溶解沉淀， 5 分钟后加 300 μl Buffer Ⅳ，上下颠倒 10 次，充分混匀；
14) 将离心柱放置在一个 2ml 的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置 2 分钟；
将离心柱和 2ml 套管一起用 8,000rpm 离心 30 秒，弃去 2ml 套管中的溶液，在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
12,000rpm 离心 30 秒，去除离心柱中痕量残余溶液；
将离心柱放置在一个新的 1.5ml 离心管中（离心管请自备），在离心柱底部中央小心加入 50 μl Elution Buffer, 于 Buffer ， 37 ℃放置 2 分钟后， 12,000rpm 离心 30 秒；
离心管中的溶液即可作为 PCR 反应的摸板。建议一个 PCR 反应使用 0.5 μl DNA, 其余样品在 -20 ℃保存备用。
玉米淀粉DNA提取操作程序
称取 2g 加入 20ml Buffer Ⅰ，充分混匀；
20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟；
加入 10ml Buffer Ⅱ，充分混匀；
20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟；
加入 10ml Buffer Ⅲ和 4ml Buffer Ⅳ，充分混匀；
65 ℃水浴保温 30 分钟
20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，吸取上清到另一新的离心管中；
加入等体积氯仿，轻轻混匀；
20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，吸取上清到另一新的离心管中；
10) 加入等体积异丙醇，混匀；
11) 常温放置 10 分钟后， 20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，弃上清，保留沉淀；
12) 在沉淀中加入 100 μl Elution Buffer, 于 37 ℃充分溶解沉淀， 5 分钟后加 300 μl Buffer Ⅳ，上下颠倒 10 次，充分混匀；
13) 取出离心柱，将离心柱放置在一个 2ml 的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置 2 分钟；
14) 将离心柱和 2ml 套管一起用 8,000rpm 离心 30 秒，弃去 2ml 套管中的溶液，在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
15 ）在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
16 ）在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
17 ）在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
18 ） 12,000rpm 离心 30 秒，去除离心柱中痕量残余溶液；
19 ）将离心柱放置在一个新的 1.5ml 离心管中（离心管请自备），在离心柱底部中央小心加入 50 μl Elution Buffer, 于 Buffer ， 37 ℃放置 2 分钟后， 12,000rpm 离心 30 秒；
20 ）离心管中的溶液即可作为 PCR 反应的摸板。建议一个 PCR 反应使用 0.5 μl DNA, 其余样品在 -20 ℃保存备用。
二． PCR扩增方法
1 35s- EPSES的PCR检测
1) 反应体系：
Taq 酶 0.5 μl (2unit)
Taq Buffer 10 ＊ 5.0 μl
DNTPs 4.0 μl
引物 -1 2.5 μl
引物 -2 2.55 μl
DNA 1.0 μl
水 33.5 μl
2) 反应程序： 96 ℃ /2 分钟，（ 96 ℃ /30 秒， 65 ℃ /1 分钟）× 30 个循环， 72 ℃ /3 分钟；
3) 凝胶电泳： 2% 琼脂糖， 100V, 60 分钟。
2 PSES- Nos的PCR检测
1 ）反应体系：
Taq 酶 0.5 μl (2unit)
Taq Buffer 10 ＊ 5.0 μl
DNTPs 4.0 μl
引物 -1 5.0 μl
引物 -2 5.0 μl
DNA 1.0 μl
水 29.5 μl
2 ） 反应程序： 94 ℃ /5 分钟，（ 95 ℃ /1 分钟， 62 ℃ /30 秒 ,72 ℃ /30 秒） 40 个循环， 72 ℃ /3 分钟；
3 ）凝胶电泳： 2% 琼脂糖， 100V, 60 分钟。
3 Lectin引物反应条件：
1 ）反应体系：
Taq 酶 0.5 μl (2unit)
Taq Buffer 10 ＊ 5.0 μl
DNTPs 4.0 μl
引物 -1 5.0 μl
引物 -2 5.0 μl
DNA 1.0 μl
水 29.5 μl
2 ） 反应程序： 96 ℃ /2 分钟，（ 94 ℃ /30 秒， 62 ℃ /30 秒 ,72 ℃ /30 秒） 40 个循环， 72 ℃ /3 分钟；
3 ）凝胶电泳： 2% 琼脂胶， 100V, 60 分钟。
