参益安神片对改善小鼠学习记忆的作用及其机制
参益安神片是在参茂五味子片川的基础上，结合文献报道按照中医理论设计而成的处方，由人参、五味子、酸枣仁、益智四种中药材组成。人参和益智仁为益智安神的常用药，酸枣仁具有养心安神、敛汗的功效，它不仅是治疗失眠不寐之药，还能滋补强壮，久服能养心健脑;加用五味子，有酸敛收涩、益气生津等功效，善治心肾两经的虚亏或不调引起的心神不安、凉悸失眠等。但复方制剂是否具有明显的改善记忆、镇静催眠的作用未见报道。本文主要对复方制剂参益安神片改善记忆作用进行药效学研究，并探讨其作用机制。
1材料与方法
1. 1实验药品及试剂复方制剂参益安神片，自制。含生药量29/片(所需药材均购于长春市宏检大药房);枣东安神颗粒(北京优你特药业有限公司)批号:130501;实验所需药物均以蒸馏水配制所需浓度。酸性正丁醇、正庚烷、邻苯二甲醛七盐酸溶液、碘试液、半肤氨酸溶液、pH7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS)、乙二胺四乙酸(EDTA)试液。
1. 2动物健康昆明鼠种(KM),18-22g，雌雄各半，购于吉太小动物用品经销处:受试小鼠引进后置于长春中医药大学动物实验室饲养。温度: 20士3摄氏度，相对湿度:50%一70% 。
1. 3实验仪器：AL 204万分之一天平(梅特勒刊毛利多仪器(上海)有限公司);CaryEc;lip、分子荧光光度计(郑州中谱仪器设备有限公司)8205恒温水浴锅(上海申生科技有限公司);T18 basic:组织匀浆仪(广州仪科实验室技术有限公司);KQ3200DB数控超声清洗器(广州仪科实验室技术有限公司);XR-3TB型跳台实验系统(); XR-XB110小鼠避暗实验系统(上海欣软信息科技有限公司);Morris水迷宫实验系统(上海欣软信息科技有限公司)。
1. 4方法将50只小鼠随机分为空白对照组、阳性对照组、高剂量组(1. 606 5 g / kg)、中剂量组(0.535 5 g/kg)、低剂量组(0.267 8 g/kg) ,3个剂量组分别灌胃给药参益安神片，空白对照组给予等量生理盐水，阳性对照组给予枣东安神颗粒，灌胃巧15d后，开始对各组小鼠进行训练并测定。
1. 4. 1跳台试验：分别将小鼠放在绝缘平台上(计时开始)。记录第2次跳下平台的潜伏期、3min内的跳下平台的错误次数和各组跳下平台的动物数。训练3d后开始测试。
1.4.2避暗实验：将小鼠置于电击室，背对洞口，先给予条件刺激(灯光)15 s，在亮灯10s后开始通电5 s(电击强度为40 V,50 Hz)。记录每只小鼠进入暗室的潜伏期、5、min内进入暗室错误的次数和各组进入暗室的动物数。并训一算5 min内进入暗室(错误反应)的百分率，训练5d后开始测试。
1.4.3水迷宫实验从训练第1天开始，每批实验各有1只小鼠给药，平行操作，5min后再给第二批小鼠注射，以此类推。每天训练4次，每次随机选择一个入水点，观察并记录小鼠寻找并爬上平台的路线图及所需时间(潜伏期)。4次训练小鼠分别从4个不同的入水点入水，如果小鼠在120s内未找到平台，需将其引至平台。这时潜伏期计为120 s，每次训练间隔
60 s，以4次的平均时间及路程作为每天的训练成绩，连续训练5d后开始测定。
1.4.4复万制剂参益安神片对小鼠腼脑内单胺类神经递质去甲肾上腺素(NE）、多巴胺(DA） ,5—羟色胺(5 -HT)的影响。
1.4.4.1脑组织NE含量测定上述实验小鼠50只，断头取脑，将脑组织用冰生理盐水清洗后吸干水分，天平称取小鼠大脑重量，将小鼠大脑沿脑中线切开，取左半脑组织加入2 ml酸
胜正丁醇后匀浆，2 500 r/min离心5 min，分别取上清液0. 4 ml，加正庚烷0. 8 ml，加0. 1 mol/L的HCl 0. 2 ml超声1 min，2 500 r/min离心5 min分别取底层水相。水相50 ul，加PBS 150ul,加EDTA 40ul，加新配制的碘液20ul,混匀，静置3 min，分别加碱性磷酸钠40闪，混匀，静置3 min，分别加醋酸40 ul,混匀，80℃水浴10 min，冷却即得。吸取各样品200 ul ，置96孔板内，进行含量测定，激发波长382/4880
1.4.4.2脑组织中DA的含量测定上述实验小鼠50只，断头取脑，将脑组织用冰生理盐水清洗后吸干水分，天平称取小鼠大脑重量，将小鼠大脑沿脑中线切开，去左半脑组织加入2 ml酸性正丁醇后匀浆，分别取上清液0. 4 ml，加正庚烷0. 8 ml，加0. 1 mol/L的HCl 0. 2 ml超声1 min，2 500 r/min离心5 min分别取底层水相。水相50 ul，加PBS 150 },1加EDTA
40闪，加新配制的碘液20闪，混匀，静置3 min，分别加碱性磷酸钠40 ul,混匀，静置3 min，分别加5 mol/L醋酸40 ul,混匀，100℃水浴15 min，冷却即得。精密吸取各样品200 ul ，置96孔板内，进行含量测定，激发波长为325 /385。记录结果。
1.4.4.3脑组织中5 -HT的含量测定上述实验小鼠50只，断头取脑，将脑组织用冰生理盐水清洗后吸干水分，天平称取小鼠大脑重量，将小鼠大脑沿脑中线切开，去左半脑组织加入
2 ml酸性正丁醇后匀浆，分别取上清液0. 4 ml，加正庚烷0. 8 ml，加0. 1 mol/L的HCl 0. 2 ml超声1 min，2 500 r/min离心5 min分别取底层水相。取水相0. 4 ml，加入0. 25%半肤氨
酸(新配)0. 1 ml，再加入0. 002% OPTO NHCI 3 mlo混匀，沸水浴10 min，冷却即得。精密吸取各样品200闪置96孔板内，进行含量测定，激发波长为368 /480 0
2结果
2. 1复方制剂参益安神片跳台实验结果阳性对照组、中剂量组潜伏期与错误次数与空白对照组比较显著差异(P<0.05或P<0. O1)，高剂量组潜伏期与错误次数与空白对照组比较有极显著性差异(P<0. O1)。
2. 2复万制剂参益安神片邂暗买验结果中刑量组错误次数与空白对照组比较有显著差异(P<0.05)，高剂量组、阳性对照组错误次数与空白对照组比较有极显著性差异(P<0. O1)，其他4组测试潜伏期与空白对照组比较均有增长。
2. 3复方制剂参益安神片水迷宫实验结果中剂量组、高剂量组实验完成时间〔(69. 84士23. 37) e , X65. 45士22.98) e〕与空白对照组〔(114. 82士7.96) e〕比较差异显著(P<0. O5)。阳性对照组为(101. 72士26. 32) e，低剂量组为(80. 50士27. 65) e o
2. 4小鼠脑内单胺举神纤涕质测宁结吴见表2}高、中剂量组脑内5-HT,DA,NE含量与空白对照组比较显著增加(P<0. OS)，低剂量组与空白对照组比较均升高，但无显著差异(P>0. OS )。
3讨论
参益安神片选取了四味常用的中药进行配伍，通过避暗试验、跳台试验、水迷宫试验可以看出无论是错误次数还是潜伏期给药组都有所改善，其药效与阳性对照药对比药效相当，因而从药效学角度看来，参益安神片的改善学习记忆作用可以得到较充分的肯定，有较好的益智作用。
单胺类神经递质包括儿茶胺和叫睬胺两类，前者包括DA,NE和肾上腺素，后者为5-HT，大脑皮质、纹状体中存在大量的DA和5 -HT能神经末梢，他们对高级活动如感情、学习、记忆起重要作用。DA含量下降是脑功能衰老的表现之一，学习记忆增强常伴有NE,DA的增加，但对5 -HT的报道还不是特别明确。参益安神片片改善小鼠学习记忆能力可能与5-HT,DA,NE的相互调节有关。相关文献报道〔7〕，神经中枢内的DA代谢会影响NE的代谢，NE可能调节广泛脑区的突触传入活动，增大环境中有意义的信息传入，而抑制其他传入刺激的干扰，从而提高注意力，增强学习能力。
本实验采用荧光法对神经递质的含量进行测定用于研究改善记忆的作用机制，荧光法与液相色谱法进行比较，荧光法实验能提高实验效率，口前试剂盒的应用也越来越广泛，可以在后续的机制研究试验中进行优选。
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