做好免疫组化染色必须注意的问题（五）
十、连接抗体的选用必须正确，否则可造成假阴性的现象。
免疫组化染色方法较多，如ABC法，SP法和EV二步法等，如果使用的是SP法，或者ABC法，这时就必须要仔细地选择好连接抗体，第一抗体有单克和多克隆炎分，连接抗体则要根据选用的抗体来进行，例如：第一抗体选用的是单克隆鼠抗人**抗体，连接抗体也要选择相应的免抗鼠IgG，这样才能连接上（目前生产厂家已生产出混合型抗体，即既适合于单克隆抗体，也适合于多克隆抗体。使用者不用担心连接不上，随便使用都可，但如果没有订购混合型的试剂盒，就必须注意的型号，使之完全适合所选用的抗体。）孵育的时间可在10分钟，20分钟或者30分钟，一般在室温中进行，如果室温低于20℃以下，则可在37℃的孵育箱中进行。
十一、复合物的使用及孵育时间的确定。
各种方法有各自的复合物，如ABC法，复合物是卵白素和生物素结合的复合物，再带有HRP，SP法，（LsAB法）的复合物是链雪菌素蛋白复合物，再带有HRP，EV二步法的复合物则是二抗和三抗连接在一起的复合物，再带上HRP，除此之外，根据水解底物的不同，可产生不同的颜色，例如：带有HRP的酶，水解的底物一般为DAB产生黄棕色，带AP的酶，水解的底物一般为AEC产生红色。
十二、PBS的冲洗
免疫组化的染色过程，除了前面的处理和加入的抗体外，都在PBS的冲冲洗洗中度过，PBS冲洗的正确与否，也是导致最后结果的关键。
1.单独冲洗，防止交叉反应造成污染。
临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。
2.温柔冲洗，防止切片的脱落。
冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲出的PBS有一定的冲击力，很容易使切片周边引起松动，导致切片的脱落。
3.冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。
冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法一是浪费时间，二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入PBS，持续2分钟左右就完全足够了。
4.PBS的PH和离子强度的使用和要求。
刘彦仿指出：中性及弱硷性条件（PH7－8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。［］免疫组化P56我们目前常用的PBS的PH在7.4-7.6浓度是0.01M，根据本室十几年来的使用情况，认为该溶液价格便宜配制方面，使用效果好。
5.常用试剂的配制和使用。
在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中，抗体的加，换，切片的冲洗，DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱，都将影响染色的结果。下面将介绍有关方面的内容：
（1）缓冲液的配制
1.磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution.PBS）
Ⅰ液：0.2M Na H2PO4贮存液（PH7.6）
取一个具500ml的容量瓶，称量15.60g NaH2PO4﹒12H2O倒入瓶中，加入少量蒸馏水使劲摇晃，直至溶解，加入蒸馏水凑足500ml。放于4 冰箱保存，配制时应注意的事项：
①在配制时，要先确定NaH2PO4的用量，因为该试剂有许多种类形，它们所含的水分子量不一样，因而它们的用量也不一样。如NaH2PO4含单个水分子时，配制时要称取13.80g，而当含有2个水分子时，则需要称取15.60g。
②配制时根据要求选取蒸馏水。因为蒸馏水有数种，单蒸馏水，双蒸馏水，玻璃蒸馏水，去离子水。如没特别要求，选用一般的蒸馏水配制则可。
③装缓冲液的瓶子须用玻璃浸洗液泡洗过，以防污染，导致溶液中有雪菌生长。
Ⅱ液：0.2M NaHPO4贮存液(HP7.6)
取500ml的容量瓶，称好17.91g NaHPO4﹒12H2O,倒入瓶中，边加水边搅拌，直至完全溶解再凑足500ml，贮存于4℃冰箱。
注意事项：
①该试剂也应注意有多种不同的含水分子量。
②该贮存液久放后可出现结晶。每次使用前，先取出回至室温，摇晃其结晶溶解，也可用微波炉促其快速溶解，然后再用。
0.01M PBS工作液的配制：
取一2000ml的容量瓶一个，装入已称好的NaCt18g，加入少量蒸馏水让其彻底溶解，再加入 Ⅰ液13ml，Ⅱ液87ml，加蒸馏水凑足2000ml，即可使用，即可使用该溶液在室温下可保存3-4周，但以新配为佳。
PBS工作液配制完毕后，都要测其PH值，如果偏酸，可用氢氧化钠来调试，如果偏碱可用HCl调试，测试有如下n种方法：
①PH测试笔测试，这是一种简便、易行、结果较为准确的测试方法。当配制完PBS后，取一小杯，倒入配好的PBS，插入测试笔，打开开关，小屏幕上将可出现测出的PH结果。PH如果7.6不足，小量的可用0.2M
Na2HPO4调校，大量的可用氢氧化钠调校。PH如果高于7.6，小量的用0.2M NaH2PO4调校，大量的可用HCL来调校。
②用试纸来测试：PH试纸有两种，一种为广泛PH试纸，范围在1-14，另一种是精密试纸有各种各样的范围。但是，作为冲洗切片用的PBS，其精确度不需要十分精确，如配PH7.6时，测试时在PH7.5或7.7，都可使用。试纸测试PH值，停靠其反应的颜色来确定，十分简便，一般的试剂都可用它来测试。
③仪器测试：对于要求较高，需较准确的PH值，须彩用仪器测试。
1.Tris缓冲溶液(Tris buffer solution,TBS)
①1N HCL ，浓HCL(双重1.19)8.3ml，先取50ml蒸馏水，加入HCL再加水到100ml。
②0.5M Tris-HCL缓冲液(PH7.6)
取Tris(羟甲基氨基甲烷)6.57g，加入少许的蒸馏水搅拌，直至溶解，再加入1N HCL42ml，然后用蒸馏水凑足100ml，于4℃冰箱保存。
临用时，将上述溶液10稀释倍，即为0.05M工作液。
注意事项：
①配制1N HCL时，如果大量配制，HCL入水时可产生很大的热量，对的所用的玻璃器皿应特别小心，以防突然产热而使玻璃器皿爆裂。
②调校PH值时，可参考上述的三种方法
