免疫组化实验原理和步骤（五）
（6）结果判断
免疫组化的结果判断有两种方法：
一是对以检测结果阳性细胞指数来定性(如核抗原的标记)，判断方法是以一个规野中阳性细胞数不总细胞癿百分比，再取10个相同视野算取平均指数。
另一种方法以染色阳性强度和阳性检出率相结合而定，一般阳性细胞数在0-25为阴性，25-50为十，50-75为十十，75以上为十十十。此种判定方法容易出现人为误差现象。有条件的实验室最好能用图像分析系统进行结果检测定量分析更为准确。一切的判定方法都是力求使免疫组化染色结果判断更标准，但各单位采取的标准不尽相同，所以判断标准化问题还有待长期实践中病理学术界商讨判定标准。
IHC中常见的抗原表达模式有以下几种：
1）细胞浆内弥漫性分布，多数胞浆型抗体的反应如此，如细胞角蛋白(cytokeratin，CK)和波形蛋白(vimentin)等；
2）细胞核周的胞浆内分布，其判别要点是细胞核的轮廓被勾画得很清楚，如CD3多克隆抗体的染色；
3）胞浆内局限性点状阳性，如CDl5抗体的染色；
4）细胞膜线性阳性，大多数淋巴细胞标记的染色如此，如CD20、CD45RO；
5）细胞核阳性，如Ki-67及雌、孕激素受体蛋白ER、PR等。一种抗体可同时出现。
细胞浆和细胞膜的阳性表达，如EMA可呈膜性和胞浆内弥漫性阳性反应；CD30抗体可同时呈膜性和胞浆内点状阳性反应等。
（7）对照片癿设置
免疫组化的质量取决于正确使用各种对照，没有对照的免疫组化结果是毫无意义的。对照包括阴性对照、阳性对照和自身对照。在实践中可用染色组织切片中不含抗原的组织作为阴性对照，而用含抗原的正常组织作阳性对照，这种自我对照具有节约的意义。观察染色结果时，先观察对照组织的结果，如阳性对照组织中阳性细胞呈强阳性，阴性对照细胞呈阴性，内源酶阴性，背景无非特异性染色时，表明本次实验的全部试剂和全过程技术操作准确无误，待检组织中的阳性细胞也就是可信的正确结果。 免疫组化染色中对照片的设置非常重要，它是判断您的染色是否成功的关键依据，而且也是检测每一个抗体的质量标准，常设的对照如下，一般实验最常用的只选第二种方法。
1）空白对照(阴性对照) 第一抗体由PBS或非免疫血清取代。
2）阳性对照 用已知含有要检测抗原的切片作阳性对照。
3）回收实验阴性对照 已知抗原不相应的第一抗体混合，发生结合沉淀，再用此沉淀抗体复合物进行免疫组化实验，结果为阴性。
4）替代对照 用于第一抗体同种动物的血清或无关抗体代替第一抗体结果为阴性。
5）自身对照 在同一切片上，应将不同组织成分中的阳性戒阴性结果不检测的目的物对照比较。如actin、CD34在正常组织中的血管壁肌层应为阳性，vimentin可以间质细胞，对照desmin以血管壁及肌束为对照，S-100蛋白以小神经末梢为对照等，如果应为阳性飞组织是阳性，则免疫组化技术正确，如为阴性，则表明染色技术有问题或免疫试剂质量有问题。
免疫组化染色
一．石蜡切片免疫组化染色实验步骤：
1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置60℃ 1小时）。
（1）二甲苯、II，各10分钟。
（2）梯度酒精：100%，2分钟® 95%，2分钟® 80%，2分钟® 70%，2分钟。
（3）蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。
2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温10分钟（避光）。
3．蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。
4．抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。
附：抗原修复液（10mM pH 6.0柠檬酸钠缓冲液）的配制
（1）储备液的配制：A液：柠檬酸三钠-2H2O 29.41g + 蒸馏水1000ml B液：柠檬酸21g + 蒸馏水1000ml
（2）工作液的配制：A液82ml + B液18ml + 蒸馏水900ml
抗原修复的方法：
（1）高压锅处理技术：柠檬酸钠缓冲液（10mM，PH6.0）,淹没切片,盖上锅盖，高压锅内煮沸,上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。
（2）微波处理技术：用塑料切片架，置亍塑料或耐温玻璃容器内，柠檬酸钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档，5分钟；叏出并补充已预热的柠檬酸钠缓冲液；再选择中高戒高档，5分钟。（最佳温度为92-95℃）
（3）酶消化处理：此略抗原修复的注意事项：
1）组织不能干。
2）选择抗原修复方法要因抗体而异。
3）该方法主要用亍10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。
4）抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。
5、PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
6、正常血清封闭：从染片缸中出取切片，擦冷切片背面水分及切片正面组织
周围的水分（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊戒兔血清（不第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。
附：正常血清配制 (或按试剂盒规定的浓度配制)
按1:20比例,用PBS配制,每张切片需要量按50ml+5ml (10%抛洒量)计算。
7、滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃、2小时 。
（也可置于4℃冰箱过夜）。
8、PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
9、滴加生物素化的二抗，37℃，40分钟。
10、PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
11、滴加三抗 （SAB复合物），37℃，40分钟。
12、PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
13、DAB显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。
附：DAB的配制
（1）储备液(DAB 25mg/ml)癿配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分装成1ml,100ul,50ul，20ul等，—20℃，冻存。
（2）工作液：DAB储备液20ul + PBS 1000ul + 3% H2O2 5ul
14．自来水（细水）充分冲洗。
15．苏木素复染，室温，30秒，自来水冲洗。
16．自来水冲洗返蓝，15分钟。
17．梯度酒精脱水：
80%，2分钟 、95%，2分钟 、100%，2次，5分钟。
18．二甲苯透明：
I，II（二甲苯）各5分钟。
19．封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。
二、细胞爬片的免疫疫组化染色： 1. 取出细胞爬片，迅速置入冷丙酮固定20-30分钟。
2. 蒸馏水浸泡5分钟，2次。
3. 打孔液浸泡5分钟。
4. 蒸馏水浸泡5分钟，2次。
5. 后接前述实验步骤的第6步（正常血清封闭）。
注：第3、4步仅用于检测细胞内抗原，检测细胞膜抗原时不用。
三、冰冻切片的免疫组化染色：
1、新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可-80℃保存),厚度为5～6mm。
2、载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。
3、如不马上染色，可密封后-20℃保存。
4、染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分钟。
5、PBS洗2次,每次5分钟,(必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔)
6、3% H2O2灭活内源性过氧化物酶,20分钟,避光；
7、用PBS洗2次,每次5分钟；
8、接前面实验步骤第六步。
四、载玻片的预处理：
1、洗衣粉液浸泡30分钟，冲洗，晾干。
2、洗液 （含强酸、高锰酸钾等）浸泡24小时，冲洗，晾干。
3、APES（1:50丙酮溶液）10-20秒（注意：不能用塑料容器及塑料切片架）。
4、纯丙酮I，约10秒。纯丙酮II，约5秒。
5、晾干或烤箱内烤干，备用。
