胰岛素受体与[125I]胰岛素的交联实验
胰岛素受体与[125I]胰岛素的交联实验
标签： 胰岛素受体 [125I]胰岛素 蛋白质纯化与鉴定实验指南 第四单元 实验 5
本实验介绍关于胰岛素受体与[125I]胰岛素的交联过程。本实验来源于蛋白质纯化与鉴定实验指南，作者：朱厚础。
胰岛素受体与[125I]胰岛素的交联实验
实验方法原理
试剂、试剂盒 纯化的鼠肝细胞质膜部分纯化的胰岛素受体纯化的胰岛素受体[125I] 胰岛素猪胰岛素双琥珀酰亚胺酰辛二酸二甲亚砜NH4Cl甘油SDS-PAGE 样品缓冲液
仪器、耗材 蛋白质凝胶电泳装置干胶器
实验步骤
材料与设备
纯化的鼠肝细胞质膜（见本单元实验 1)
部分纯化的胰岛素受体，得自 WGA-琼脂糖柱层析（见本单元实验 3)
纯化的胰岛素受体，得自胰岛素琼脂糖柱层析（见本单元实验 4)
[125I] 胰岛素（受体级）（DuPont NEN NEX 196)
猪胰岛素（17.5umol/L)(如，Sigma Chemical Co.13505)
双琥珀酰亚胺酰辛二酸（Pierce Chemical Co.21555)
二甲亚砜（DMSO)
NH4Cl(1mol/L)
甘油（10%;v/v)
蛋白质凝胶电泳装置（BioRad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)
干胶器 (Bio-Rad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)
试剂
SDS-PAGE 样品缓冲液（5x)
(配方，见“试剂的配制”，pp.234~240)
操作程序
1）建立如下反应体系:
2) 反应混合物于室温孵育 2 h。
3) 溶双琥珀酰亚胺酰辛二酸于 DMSO 中，使终浓度为 10 mmol/L。
4) 每管加入 6ul 10 mmol/L 双琥珀酰亚胺酰辛二酸，室温孵育 1 min。
5) 加1ul 1mol/L NH4Cl 终止反应。
6) 加 15ul 5xSDS-PAGE 样品缓冲液。
7) 样品煮沸 5 min。
8) 加样至 7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。170V 电压下电泳，至染料前沿跑出凝胶。（关于 SDS-PAGE 的详细资料，见附录 5)
9) 将凝胶置 10% 甘油中孵育后，在干胶器上干燥。
注：蛋白质也可转移至硝酸纤维素膜上，如本单元实验 6 所述。
10）用放射自显影法鉴定亲和标记的胰岛素受体。
结果
交联实验的典型结果如图 4-6 所示。
