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胰岛素受体与[125I]胰岛素的交联实验

2019.9.13

  • 胰岛素受体与[125I]胰岛素的交联实验

           

实验方法原理
试剂、试剂盒

纯化的鼠肝细胞质膜 部分纯化的胰岛素受体 纯化的胰岛素受体 [125I] 胰岛素 猪胰岛素 双琥珀酰亚胺酰辛二酸 二甲亚砜 NH4Cl 甘油 SDS-PAGE 样品缓冲液

仪器、耗材

蛋白质凝胶电泳装置 干胶器

实验步骤

材料与设备

纯化的鼠肝细胞质膜（见本单元实验 1)

部分纯化的胰岛素受体，得自 WGA-琼脂糖柱层析（见本单元实验 3)

纯化的胰岛素受体，得自胰岛素琼脂糖柱层析（见本单元实验 4)

[125I] 胰岛素（受体级）（DuPont NEN NEX 196)

猪胰岛素（17.5umol/L)(如，Sigma Chemical Co.13505)

双琥珀酰亚胺酰辛二酸（Pierce Chemical Co.21555)

二甲亚砜（DMSO)

NH4Cl(1mol/L)

甘油（10%;v/v)

蛋白质凝胶电泳装置（BioRad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)

干胶器 (Bio-Rad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)

试剂

SDS-PAGE 样品缓冲液（5x)

(配方，见 试剂的配制，pp.234~240)

操作程序

1）建立如下反应体系:



2) 反应混合物于室温孵育 2 h。

3) 溶双琥珀酰亚胺酰辛二酸于 DMSO 中，使终浓度为 10 mmol/L。

4) 每管加入 6ul 10 mmol/L 双琥珀酰亚胺酰辛二酸，室温孵育 1 min。

5) 加1ul 1mol/L NH4Cl 终止反应。

6) 加 15ul 5xSDS-PAGE 样品缓冲液。

7) 样品煮沸 5 min。

8) 加样至 7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。170V 电压下电泳，至染料前沿跑出凝胶。（关于 SDS-PAGE 的详细资料，见附录 5)

9) 将凝胶置 10% 甘油中孵育后，在干胶器上干燥。
注：蛋白质也可转移至硝酸纤维素膜上，如本单元实验 6 所述。

10）用放射自显影法鉴定亲和标记的胰岛素受体。

结果

交联实验的典型结果如图 4-6 所示。


胰岛素受体
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