农杆菌介导的大麦转化方法实验
实验材料 植物凝胶pBract 质粒pSoup 质粒
试剂、试剂盒 利福平卡那霉素
仪器、耗材 MG L 培养基
实验步骤
1. 组织培养基的准备
提前准备好所需浓度 2 倍的植物凝胶，高压灭菌（见注 3 ) 。所有的组织培养基都要过滤灭菌，因此除了无菌的储备液，其他培养基成分按所需浓度 2 倍的量混匀，调到合适的 pH 后 ，过滤灭菌（使用瓶顶过滤器， 0.22 μm 微孔滤膜，Millipore) 。使用前将 2x 凝胶和 2x 培养基在水浴锅中加热至 60℃。将所需储备液在无菌条件下加入到热的培养基中，培养基和植物凝胶混合后倒入 9 cm 培养皿中（Sterilin ) 。分化培养时，将培养基倒入较深的组织培养皿中（100 mm X 20 mm， Falcon) 。
2. 根瘤农杆菌接种前的准备工作
( 1 ) 标准接种液制备采用文献 [ 2 ] 中介绍的方法，稍作修改。
( 2 ) 挑取一个含有 pBract 质粒和 pSoup 质粒的 AGL1 农杆菌单克隆，接种于 10 ml 含 25 μg/ml 利福平和 50 μg/ml 卡那霉素的 MG/L 培养基中，于 28℃、180 r/min 振荡培养 40 h。
( 3 ) 将 10 ml 无菌的 30% 甘油加入细菌悬浮液中，颠倒混匀数次。
( 4 ) 将 400 μl 标准接种液分装于 0.5 ml 的离心管中，室温放置 2 h，每 30 min 颠倒混匀一次。
( 5 ) 将标准接种液置于 -80°C 储存。
3. 分离大麦幼胚
(1) 幼穗的收采与消毒
① 当幼胚直径长到 1.5~2 mm 时米收麦穗 （见注 4) 。
② 在剪取麦穗之前，从每穗中间取一粒种子，检查幼胚的大小，确保达到要求 [图 9.2 (a) ~(c) ] 。
③ 取下成熟种子，去芒，但不要破坏种壳。
④ 先用 70% 乙醇消毒 30s，再用无菌水冲洗 3 次。
⑤ 在次氯酸钠（次氯酸钠溶液，Fluka71696 ) 与水比例为 50:50 的溶液中浸泡 4 min。
⑥ 用无菌水洗涤 4 次后，将水倒掉但保持种子湿润，置于无菌的螺口瓶中待用。
(2) 分离幼胚并移除胚轴
① 所有的操作均在无菌操作台上进行。
② 每次大约取 20 粒消毒过的种子置于解剖镜无菌的蓝色或黑色底板上。
③ 用一只镊子固定种子，另一只镊子剥出幼胚，去除胚轴（见注 5 ) [图 9. 2 ( c )~( d ) ]。
④ 幼胚盾片朝上，置于愈伤组织诱导培养基上。
⑤ 每个直径 9 cm 的培养皿放 25 枚幼胚，准备接种农杆菌，23~24°C 暗培养。
4. 农杆菌的准备、接种与共培养
( 1 ) 将农杆菌标准接种液加入 10 ml MG/L 液体培养基中，不加抗生素，28℃ 下 180 r/min 培养过夜（大约 20 h ) 。
( 2 ) 用农杆菌培养液原液接种幼胚。
( 3 ) 用 200 μl 的移液枪将少量农杆菌滴在每个幼胚上，使其刚好覆盖幼胚的表面。
( 4 ) 处理完一个培养皿中的 25 个幼胚后，将培养皿倾斜，使幼胚上多余的农杆菌流出。
( 5 ) 每次最多接种 2 个培养皿的幼胚，然后将幼胚小心转移至另一个新鲜的诱导培养基上，盾片朝下。
( 6 ) 注意不要将多余的培养基或农杆菌带入新的培养基，必要时可将幼胚轻轻地在培养基上划动以去除多余的农杆菌再转入新的培养基。
( 7 ) 用医用胶带将培养皿密封，23~24°C 培养 3 天。第一天分离幼胚、第二天接种比较方便，当然也可以在分离幼胚当天接种（见注 6) 。
5. 转化子的筛选
( 1 ) 共培养 3 天后，将幼胚转移至含有潮霉素和特美汀的愈伤组织诱导培养基中，潮霉素用于选择培养，特美汀用于抑制农杆菌（见注 7) 。
( 2 ) 幼胚盾片朝下，23~24°C 黑暗培养。该步骤称为选 1。
( 3 ) 2 周后，将胚转移至新的选择培养基上（选 2 ) 。同一个幼胚及其长出的愈伤组织作为一个整体进行转移，不要分开。
( 4 ) 继续培养 2 周后，将胚转移至新的选择培养基上（选 3 ) (见注 8 ) ，在这一时期，愈伤会从胚上脱落，将其放在该胚周围并做好标记，以便追踪来源于同一个幼胚的所有愈伤组织的生长情况。
( 5 ) 减少每皿胚的数量，因为胚来源的抗性愈伤将开始快速生长。
( 6 ) 在愈伤组织诱导培养基上选择培养 6 周后，将愈伤组织转移至含有潮霉素和特美汀的过渡培养基上。于 24℃、弱光下培养 2 周 ，即把培养皿放到有光照的组织培养室中，用薄纸片将培养皿盖住以获得较暗的光线。经过这两周的培养之后，转化的愈伤可明显区分且开始出现绿色区域和小的嫩芽。未转化的愈伤在含潮霉素的培养基上几乎不分化。
6. 转基因植株的再生
( 1 ) 在过渡培养基上培养 2 周后，最终将胚性组织转移至再生培养基上，用高的培养皿，培养基不加任何生长调节剂，但含有相同浓度的潮霉素和特美汀。
( 2 ) 由于转化的愈伤会长得非常快，需进一步减少每个培养基中的愈伤数。
( 3 ) 典型再生中的愈伤形态见图 9.3 ( a ) 和图 9.3 ( b ) 所示。同一幼胚来源的再生愈伤要放在一起。
( 4 ) 当幼苗的芽长至 2~3 cm，也形成根时，从培养皿中移出，转移到含有 12 ml 愈伤组织诱导培养基的玻璃试管（Sigma C-5916) 中，该培养基不加麦草畏或其他生长调节剂，但仍需加相同浓度的潮霉素和特美汀。
( 5 ) 转移至试管中生长的植株如图 9.3 ( c ) 和图 9.3 ( d ) 所示。转基因植株在含有潮霉素的生根培养基中能很快形成强壮的根系。
( 6 ) 在含有潮霉素的培养基中能形成强壮根系的植株，往往都是转化成功的，用这种筛选方法不会有逃逸或非转化的植株存活下来（见注 9) 。
( 7 ) 当生根的植株长至试管顶部，便可将其转移至土壤中。
( 8 ) 用长镊子轻轻地将幼苗从试管中移出，根部的组织培养基用水冲洗干净，种植于直径 5 cm、装有相同大麦生长介质种的盆中。
( 9 ) 幼苗可单独用有孔的小塑料杯罩住或整盆用盖子罩住以保持湿度，直至幼苗在土壤中定植良好。
( 10 ) 当幼苗在土壤中扎根后，就可以取叶片分析目的基因是否存在。图 9. 4 显示转基因植株叶片中 gus 基因的表达情况。
