根癌农杆菌诱发冠瘿瘤现象观察
一、原理
冠瘿瘤是根癌农杆菌感染双子叶植物后形成的一种形似帽状的瘤组织，该组织能在正常细胞不能生长的无激素培养基上无限制地生长。冠瘿瘤的形成，是由于根癌农杆菌Ti质粒上的T－DNA（可转移DNA，其中含致病和冠瘿碱合成酶等基因）整合到宿主植物细胞染色体DNA上的结果。在植物基因工程研究中，以野生型Ti质粒接瘿实验为基础，对于快速确定最佳外植体、农杆菌类型和转化程序，对于获得理想的转化结果是十分有利的。诱发冠瘿瘤形成可以在开放性整体植株上进行，也可在无菌的外植体上进行。本实验采用后一种方式。
二、目的
了解根癌农杆菌介导的天然植物转化现象及植物冠瘿病的特征，掌握利用根癌农杆菌感染植物的基本方法。
三、材料、试剂
1、烟草、甘蓝种子。
2、野生型根癌农杆菌或含pgl2215或pgl2219的农杆菌株。
3、70％乙醇。
4、10％漂白粉。
5、0.1%升汞。
6、LB或YEB平板培养基。
7、0.7%琼脂糖平板。
四、操作步骤
1、把甘蓝种子用蒸馏水冲洗，浸入70％乙醇中摇动2分钟，再用10％漂白粉或0.1%升汞溶液消毒2－5分钟。用无菌水冲洗5次，然后接种在仅有0.7%琼脂的平板上。
2、于12000 lx光照16小时，黑暗8小时，24℃，70％相对湿度条件下培养4－6周。
3、切取下胚轴和茎段，每段约长1厘米，顺极向插入仅有0.7%琼脂的培养基上，切勿倒置。
4、将野生型根癌农杆菌在LB或YEB平板上划线，28℃培养过夜。
5、挑取极少量菌体涂在胚轴或茎段的切面上，也可用微量进样器将新培养的菌液滴加到切口面上，操作时注意不要让菌液污染培养基，封口，继续在培养室内培养。
6、培养4天后观察，可见材料切口面膨大，诱导出冠瘿瘤。
7、检测冠瘿瘤中的冠瘿碱，或进行离体培养及诱导植株再生。
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