农杆菌介导的遗传转化程序
实验概要
农杆菌侵染实验
实验步骤
(1) 农杆菌菌液的制备
将农杆菌接种于附加50mg/L Km、50mg/L Sm、50mg/L
Rif的YEB固体培养基上,28℃暗培养,至长出单菌落。用接菌环挑取单菌落,接种在5mL含相应抗生素的YEB液体培养基中,于28℃,200r/min
培养过夜。待菌液长至OD600为0.4 ~ 0.6时,将其按1∶10的比例接种到新鲜的上述培养基中振荡培养,进行二次活化。当OD600为0.5
~ 0.6 时,吸取菌液于无菌离心管中,2000 r/min离心10min,去上清,用等体积的YEB液体培养基重悬,备用。
(2) 侵染
取继代8天的愈伤组织,置于无菌三角瓶内,加入适量重悬好的菌液,浸泡15~20 min,此间要不时的摇动。浸泡完后,弃菌液,用无菌滤纸吸干多余的菌液。
(3) 共培养
侵染过的愈伤组织接种于共培养培养基(含有100mg/L阿魏酸的继代培养基)上,28℃暗培养3~5d,以肉眼可见菌落为准。
(4) 除菌
取共培养后的愈伤组织,放于无菌三角瓶内,先用无菌水冲洗至溶液澄清为止,然后转入液体继代培养基 100mg/L Ac,120r/m震荡培养过夜,其间每隔2~3小时换一次液,再冲洗2~3次后转到附加100mg/L Ac的固体继代培养基上。
(5) 筛选
将除菌一周后的植物材料转至分化筛选培养基MS 2mg/L 6-BA 30g/L Suc. 100mg/L Ac 0.7mg/L Bia中进行转化筛选及除菌,同时诱导再生植株,两周继代一次。