人工免疫原的制备-2
四、连接方法
半抗原与载体的连接通常可用物理和化学方法进行。物理吸附的载体有羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，它们借电荷和微孔吸附半抗原。化学法则是利用某些功能基团把半抗原连接到载体上，这些载体包括血清白蛋白、甲状腺球蛋白、铜蓝蛋白、卵蛋白和人工合成的多聚赖氨酸。带有游离氨基或游离羧基以及两种基团都有的半抗原，可直接与载体连接。其他不带有氨基或羧基的半抗原，须加以适当的改造，使其转变为带有游离氨基或游离羧基的衍生物，才能与载体连接。
1、有游离氨基或游离羧基以及两种基团都有的半抗原与载体的连接方法
（1）碳化二亚胺法
碳化二亚胺是一种化学性质非常活跃的双功能试剂，它们既可与半抗原上的羧基又可与半抗原上的氨基缩合。
此法非常简便，只要将半抗原与载体蛋白质按一定分子比混合在适当的溶液中，然后加入碳二亚胺，搅拌l～2h，置室温反应24h，最后透析除去未反应的半抗原，即可得到人工免疫原。
（2）戊二醛法
戍二醛是带有两个活性基团双功能的连结剂，它借助两端的醛基与载体和半抗原的氨基以共价键连接。
（3）混和酸酐法
混合酸酐法又称为氯甲基异丁酯法，主要用以甾体激素与蛋白质的偶连。以烷基氯甲基为偶连剂，最常用的是氯甲基异丁酯。含有羧基的半抗原与氯甲基异丁酯反应形成混合酸酐，然后在与蛋白质载体上的氨基反应形成肽键。
（4）过碘酸氧化法
过碘酸将糖环氧化成双醛基，再与蛋白质上的氨基偶联。本法常用于配糖体类药物与蛋白质的偶联。
2、带有氨基或羧基的半抗原可用下面方法改造后，再用上述方法进行连接
（1）琥珀酸酐法
本法用于带有羟基的半抗原的改造。琥珀酸酐加水转变成琥珀酸。如将带有羟基的半抗原和琥珀酸酐在无水吡啶中反应，即可得到带有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物。
（2）羧甲基羟胺法
带有酮基的半抗原（如孕酮、睾酮）与O-（羧甲基）羟胺反应，转变为带有羧基的半抗原衍生物。
（3）重氮化的对氨基苯甲酸法
本法适于带有酚基的半抗原（如某些药物）的改造。先将对氨基苯甲酸和亚硝酸钠反应，反应产物再作用于带有酚基的半抗原，从而制得带有羧基的半抗原衍生物。
（4）一氯醋酸钠
本法适于带有酚基半抗原的改造。将带有酚基的药物与一氯醋酸钠反应即可得到带有羧基的半抗原衍生物。
五、人工免疫原的鉴定
1、抗体的特异性
为获得特异性强的抗体，并不是半抗原分子上任何功能基团都可以用来与蛋白质联接，也不是毫无选择的在半抗原分子上添加可以与载体联接的功能基团。根据目前的认识，抗体的特异性主要是针对距蛋白质联接点最远端的半抗原部分。因此，应将对免疫识别来说最不重要的半抗原部分联接到蛋白质上。这就是所谓的联接半抗原的"远距离"原则。如雌二醇的特殊功能基团有两个，即C3-OH和C17-OH。如在C6位与蛋白质联接，形成E2-6-（O-羧甲基）肟，则所得到的抗血清的特异性就好；如在C17位与蛋白质联接，形成E2-17-半琥珀酸酯，则所得到的抗血清的特异性就差。前者与雌素酮和雌三醇的交叉广反应率分别为8.0%和0.3%，而后者分别为100%和10%。在实际联接时可用特殊试剂将特异的功能基团封闭，然后进行偶联，最后再将封闭剂去掉。
2、半抗原的取代水平
半抗原联接到载体蛋白上的分子数可影响动物产生抗体的能力。结合半抗原的多少，依半抗原的性质和动物的品种而异。文献报告每个载体分子只含一个半抗原分子就足以产生半抗原的抗体。一般认为，如以白蛋白为载体，每个白蛋白分子上联接5～30个半抗原分子较好。从有利于激发对半抗原亲和力强的抗体产生细胞，联接到蛋白质上的半抗原数少一些可能更好。但也有人认为，在免疫后期某些细胞逐渐对半抗原显示足够高的亲和力，以致能用半抗原-异源载体（即与初始免疫时所用的载体不同）结合物进行触发，此时免疫应答的大小可能部分的与半抗原的取代数目有关。
半抗原的取代水平可用放射性示踪法或分光光度法进行测定。
六、放射性示踪法
在偶联的反应液中加入一定量的放射性标记半抗原。偶联反应后经充分透析，测量透析袋中的放射性计数，并计算结合到载体上的放射性百分数。这个百分数指示有同样百分比的非标记半抗原联接到载体上。结合抗原中半抗原与蛋白质的分子比可用下列公式计算：
[Pm1 / MW1 ] / [m2 / MW2 ]
其中：P = 放射性百分数；m1 = 半抗原投入量；MW1 = 半抗原的分子量； m2 = 蛋白质的投入量； MW2 = 蛋白质的分子量。
七、分光光度法
根据半抗原的克分子消光系数估算：配制相同浓度的偶联物和纯蛋白溶液，分别在同一波长下读取OD值，然后按下列步骤计算：
半抗原OD值= 偶联物OD值－纯蛋白OD值
半抗原克分子浓度= 半抗原OD值/ 克分子消光系数
蛋白质浓度= 偶联物浓度－半抗原浓度
蛋白质克分子浓度= 蛋白质浓度/ 蛋白质的分子量
[半抗原分子/ 蛋白质分子]比值= 半抗原克分子浓度/蛋白质克分子浓度
应用本法计算时应注意两点：
1、读取OD值可选用任何波长，但偶联物与纯蛋白的OD值应有尽可能大的差异。即纯蛋白的读数要尽可能的低，以减少误差。同时该波长处，半抗原的克分子消光系数应为已知，否则须先用半抗原的纯品通过实验求出。
2、由于联接上了若干分子半抗原，所以偶联物的分子量实际大于纯蛋白质的分子量，故计算的第一步有一定的误差。但蛋白质的分子量远大于半抗原，所以如果波长选择适当，使蛋白质的OD值尽量的小，则这种误差不会很大。半抗原与载体结合的数目与免疫原性密切相关。一般认为至少要有20个以上的半抗原分子连接到一个载体分子上，才能有效地刺激免疫动物产生抗体。因此，在半抗原与载体连接后，应测定偶联到载体上的半抗原量。常用吸收光谱分析法测定，如果半抗原基团有适宜的吸收光谱，测定在一定波长下复合抗原和载体之间克分子吸广度的差别，然后把这个差别与同样波长下半抗原的克分子吸光度数相比较，就可以准确地计数所结合的半抗原分子数。亦可应用同位素标记半抗原渗入法，在偶连反应液中加入一定量的放射性标记的半抗原。偶连反应后经充分透析，测量透析袋中的放射性计数，计算结合到载体上的半抗原分子数。
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