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蛋白纯化的首选标签His-tag的优势及应用

2020.5.12

His标签蛋白纯化工具-蛋白纯化必备

在大肠杆菌和别的原核系统中表达的多组氨酸标签重组蛋白一般运用固定的金属离子亲和色谱来纯化或称为 IMAC. 在这个进程中，支撑物 (一般是珠状琼脂糖凝胶或磁珠颗粒) 用适宜的耦合试剂来进行衍生，比方氨三乙酸 nitrilotriacetic acid (NTA) 或亚氨乙酸 iminodiacetic acid (IDA). 这些螯合的基团会固定所需求的二价金属离子 (比方镍，铜，钴和锌)，然后这些金属离子最后担任联系和别离混合液蛋白中的目标分子。在挑选运用哪个配基上，你需要考虑 IMAC 树脂的结合能力主要取决于被纯化蛋白的性质和在纯化进程中所运用的金属离子。

NTA，IDA，IMCA形式的His标签纯化填料或者预装柱产品，高效纯化His标签融合蛋白

His-Tag亲和层析填料

His-Tag可与多种金属离子发生特殊的相互作用，如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+，Fe3+等，其原理是利用蛋白质表面的特性，使之被吸附在凝胶柱上，从而达到分离纯化蛋白的目的。

Ni2+在亲和纯化实验中的使用最为广泛。根据结合基团的不同，Ni2+亲和层析柱可分为俩类——Ni-IDA和Ni-NTA。Ni2+有六个螯合价位，其中Ni-IDA螯合了三价，Ni-NTA螯合了四价。所以IDA的载量要比NTA的高，在同样条件下Ni-IDA洗脱时的咪唑浓度也高于Ni-NTA。但其弱的结合力使金属离子在洗脱阶段时很容易浸出，与目的蛋白紧密结合，从而导致分离蛋白产量偏低，产品不纯及金属离子污染等问题。而NTA的颗粒粒度均匀，粒径更小，并且螯合镍更稳定，能耐受较高的还原剂，使填料更加稳定，镍离子不易脱落。

His-tag作为蛋白纯化时的首选标签，其优势在于：

1. N-端的His-Tag与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达；

2. 采用IMAC（固定化金属离子亲合层析）纯化His-Tag融合蛋白操作更加简便；

3. His-Tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响，不会改变目的蛋白本身的可溶性和生物学功能；

4. His-Tag非常小，在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响；His-Tag的免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体；

5. 与其它亲和标签构建成双亲和标签，并可应用于多种表达系统；

His-Tag融合蛋白的适用范围也较广，既可以在非离子型表面活性剂存在的条件下纯化，也可以在变性条件下进行纯化。前者通常用来纯化疏水性强的目的蛋白，而后者则通常纯化包涵体蛋白。

IMAC在通常的情况下是比较稳定的，但螯合剂的存在则会导致其金属离子脱落。例如在E.coli的裂解液中普遍存在一些非特异的弱螯合剂，如在三羧酸循环中产生了二羧酸类物质。因此，E.coli在某些高压情况下就会产生高特异性的金属螯合剂（通常存在于细菌的细胞周质中），导致His-Tag融合蛋白纯化的纯度和产量大大降低。所以在进行纯化His-Tag融合蛋白的实验时，首先需要去除螯合剂。

PurKine™ His-Tag 纯化系统基于创新的高载量IMAC基质，确保一步操作即可从总裂解液中高效纯化出His-Tag蛋白。我们ZL的金属离子螯合方案使其可兼容：还原剂（如 DTT）、螯合金属蛋白酶抑制剂（如EDTA）和大部分缓冲液底物和盐环境。 PurKine产品线具有多种形式如：自由组合：螯合基团 (IDA，NTA or Super NTA)，交联介质 (4% 或 6% 交联的琼脂糖凝胶，磁珠）,和金属离子 (Ni，Co,Cu,无金属IMAC) ，ZL的的组装螯合配方，保证了His标签蛋白质的最大产量，稳定性以及可溶性。

Fig. 1. His标签重组蛋白纯化结果。PurKine™ His-Tag Ni-NTA Resin 4FF (Lane B)

其它品牌的对应的纯化产品 (Lane C)

PurKine™ His-Tag的纯化填料也可以以预装柱和试剂盒的形式提供，使用更加便捷。此外，还有琼脂糖凝胶树脂填料和磁珠形式。

PurKine™ His-Tag Ni-Super Resin 是 Ni-NTA Resin 的卓越替代品，比起NTA，Ni-Super 与 Ni 有更紧致结合构象，螯合更加稳定，能更高限度的兼容各类化学物质，比如还原剂、螯合剂。PurKine? His-Tag Ni-Super Resin特别适用于含有会引起Ni离子脱落介质的样品中的His-Tag蛋白的纯化，比如含有螯合剂的分泌蛋白样品溶液。此外，它还具有高流速的特性，适合用于蛋白质的大规模纯化。