miRNA qPCR Detection Primer Set（miRNA检测试剂盒）实验说明
一、概述
1、介绍
microRNA(miRNA)是一类有大约22 个核苷酸组成的非编码小分子RNA，其广泛存在于真核生物中。miRNA 在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式，都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作用。迄今为此，对miRNA 的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法，这些方法敏感度低、耗时长、RNA 的用量较大。miRNA Q-PCR etection Kit采用了国际上公认的核酸检测标准技术――Real-Time PCR 技术来对miRNA 进行检测，其具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。
2、实验原理
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set包含了miRNA特异的逆转录引物，以及qPCR正、反向引物套装。其中茎凸环结构状的miRNA特异逆转录引物可特异性的转录成熟的miRNA。再利用高度特异的正反向引物，使miRNA定量即灵敏又高度特异。
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set提供了一种最低能检测到5个拷贝目标miRNA的高灵敏度的检测方法，并且具有一个7 个数量级的动态变化范围，反应的模板可以是总RNA或者已纯化的小RNA等。
3、产品内容
名称
介绍
量
RT Primer
miRNA Reverse Transcription Primer
2 nmol
Forward Primer
miRNA Forward Primer
2 nmol
Revers Primer
Universal Reverse Primer
2 nmol
二、实验准备
1、客户需自己提供实验试剂
一步法或两步法qPCR mix，反转录酶，RNA 酶抑制剂，DEPC-H2O 等
2、耗材准备
无RNase，DNase 的吸头，离心管等
3、引物准备
引物为干粉形式，需先离心，后每管加入200 μL DEPC-H2O稀
释至10μM，混匀后于-20oC冻存备用
4、仪器准备
离心机、实时荧光定量PCR 仪等
三、实验步骤
1．两步法扩增
先将miRNA做反转录miRNA cDNA，然后再进行qPCR定量
1.1 RT Primer Mix的配置
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set可以同时检测50个以内的miRNA分子。反转录之前，需预先配置RT Primer Mix(200nM)。如果需要用5S rRNA 或U6 snRNA 做内参对照，需同时配置Random Primer或内参的Reverse Prime做反转录引物。
1.2 逆转录体系
试剂
体积
终浓度
RNA模板
0.2ng~1μg
根据实验需求
RT Primer Mix
5 μl
20nM
10×RT Buffer
5 μl
1×
RNase inhibitor
见试剂供应商说明书
dNTP (2.5mM)
4 μl
200nM
逆转录酶
见试剂供应商说明书
DEPC-H2O
补足至50μl
1.3 逆转录程序
反应完成后，将miRNA cDNA存放于-20℃（长期保存请分装保
存于-80℃）。
1.4 miRNA实时定量 PCR反应体系
1.5 实时定量 PCR反应程序
2．一步法扩增：
将miRNA反转录和qPCR定量两个过程放在一个管子中进行
2.1 一步法miRNA定量体系的建立
2.2 实时定量 PCR反应程序
来源：百奥迈科生物技术有限公司
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