溶菌酶的制备及其性质测定的原理和操作方法
实验概要
本实验介绍了溶菌酶（lysozyme）的制备及其性质测定的原理和操作方法。
实验原理
溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为 1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N- 乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50度，最适PH为6～7左右。在280nm的消光系数为 13.0。该酶活性可被一些金属离子Cu2 ，Fe2 ，Zn2 （10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2 ,Ca2 （10-5～10-3M）、NaCl所激活。
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。
溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先后采用等电点法，D152型树脂柱层析法除杂蛋白，再经Sephadex G-50层析柱进一步纯化。最后用SDS-PAGE 鉴定为一条带。采用福林酚法测蛋白含量，分光光度法测定酶活性。
主要试剂
1. 鸡蛋清（鲜鸡蛋）
2. 底物微球菌粉
3. D152大孔弱酸性阳离子交换树脂
4. 固体氯化钠（NaCl）
5. 固体硫酸铵(NH4)2SO4
6. 固体磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）
7. 固体磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）
8. 固体磷酸钠（Na3PO4）
9. 乙醇；蒸馏水；甲醇；考马斯亮蓝；三氯醋酸；丙酮
10. 溶菌酶标准品；Sephadex G50
11. N-乙酰葡萄糖胺；硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌；氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸
12. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂;蛋白含量测定（福林法）试剂
13.聚乙二醇-20000、两性电解质
主要设备
1. 循环水式真空泵 HSB-IⅡ
2. 蛋白紫外检测仪
3. 记录仪
4. 紫外分光光度计
5. 梯度混合器(500mL);
6. 721型光分光光度计
7. 冰冻离心机
8. 冰箱
9. 透析袋
10. 酸度计
11. 部分收集器
12. 恒流泵
13. 圆盘电泳装置
14. 恒温水浴锅
15. 层析柱(2.6×1250px)(1.6×750px)
16. 布氏漏斗(500mL)
17. 吸滤瓶 (1000mL)
18. G-3砂芯漏斗(500mL)
实验步骤
1. 蛋清的制备
将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出（鸡蛋清pH 值不得小于8），轻轻搅拌5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带块，量体积约为100ml.
2. 鸡蛋清粗分离
按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水，均匀后在不断搅拌下用1mol/L HCl调pH值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。
3. D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析
1) D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用1mol/L NaOH搅拌浸泡并搅拌4～8小时，抽滤干NaOH, 用蒸馏水洗至近pH7.5, 抽滤干, 再用1mol/L HCl按上述方法处理树脂，直到全部转变成氢型，抽滤干HCl , 用蒸馏水洗致近pH5.5，保持过夜，如果pH之不低于5.0，抽滤干HCl,用2mol/LNaOH处理树脂使之转变为钠型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加pH6.5 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。
2) 装柱：取直径40px，长度为750px的层析柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至15～500px高度即可。于柱子顶部继续加入 pH6.5, 0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面25px左右。
3) 上柱吸附：将上述蛋清溶液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，流速为1ml/min。
4) 洗脱：用柱平衡液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含1.0mol/L NaCl的pH值6.5，浓度为0.02 mol/L 磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液。
5) 聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液合并装入透析袋内，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加盖，酶液中的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。当浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。
6) 透析除盐：蒸馏水透析除盐24小时。
4. Sephadex G50分子筛柱层析
1) 装柱：先将用20%乙醇保存的Sephadex G50抽滤除去乙醇，用 6g/LNaCl溶液搅拌Sephadex G50数分钟，再抽滤，反复多次直至无醇味为此。(如果Sephadex G50是新的，则按实验五中的方法处理凝胶)。加入胶体积1/4的6g/L NaCl溶液，充分搅拌，超声除去气泡，装入玻璃层析柱（1.6×1250px），柱床1125px。
2) 上样。
3) 洗脱:样品流完后，先分次加入少量6g/L NaCl洗脱液洗下柱壁上的样品，连接恒流泵，使流速为0.5mL /min，用部分收集器收集，每10分钟一管。
4) 聚乙二醇浓缩：合并活性峰溶液，用聚乙二醇浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。
5) 透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时。收集透析液，量取体积。
5. 溶菌酶活力测定
1) 酶液配制：准确称取溶菌酶样品5mg, 用0.1mol/L,pH6.2磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶液，再将酶液稀释成50µg/ml。
2) 底物配制：取干菌粉5mg加上述缓冲液少许，在乳钵中（或匀浆器中）研磨2分钟，倾出，稀释到15～25ml，此时在光电比色上的吸光度最好在0.5～0.7 范围内。
3) 活力测定：先将酶和底物分别放入25度恒温水浴预热10分钟，吸取底物悬浮液4mL放入比色杯中，在450nm波长读出吸光度，此为零时读数。然后吸取样品液0.2mL（相当于10µg酶），每隔30s读1次吸光度，到90s时共计下四个读数。
活力单位的定义是：在25℃，pH6.2，波长为450nm时，每分引起吸光度下降0.001为1个活力单位。
酶的活力单位数=△A450nm/t×0.001
比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质
6. 蛋白质含量的测定
采用Folin-酚试剂法进行测定。
7. 纯度检测
采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。
8. 理化和酶学性质的测定
可根据酶纯化和活力测定的结果，运用已掌握的生化知识和实验技能自行设计方案进行探索研究。
9. 实验结果
步骤项目 | 体积(ml) | 总蛋白量(mg) | 总活力单位 | 比活力(单位/mg) | 回收率(%) |
1.制备蛋清 | |||||
2.溶菌酶分离 | |||||
3.D152树脂柱层析 | |||||
4. Sephadex G50层析 |
