植物总RNA的提取实验技术
一、实验目的
通过本实验学习从植物组织中提取RNA的方法
二、实验原理
RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的 RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。
三、仪器、药品与试剂配方
(一) 仪器
1． 低温离心机
2． 分光光度计
3． 琼脂糖胶电泳系统，用前先用1% Na OH溶液浸泡过夜，之后再用DEPC水浸泡冲洗。
4． 高压灭菌锅
5． 研钵、剪刀、一次性手套等
易 (二) 药品
1. 焦碳酸二乙酯(DEPC)
2. 吗啉代丙烷磺酸(MOPS)
3. 异硫氰酸胍
4. 醋酸钠(NaAc)
5. 氯仿
6. 苯酚
7. 甲醛
8. 乙醇
9. 乙二胺四乙酸(EDTA)
10. 琼脂糖
11. 异丙醇
(三) 试剂配方
1． 0.1% DEPC水
0.1 ml DEPC 加入 100 ml三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。
2. 2 mol/L NaAc、0.5 mol/L EDTA、4 mol/L异硫氰酸胍、 4 mol/L LiCl等均用DEPC水 配制。
3. 5ΧMOPS 电泳缓冲液 (pH 7.0)
MOPS 0.1 mol/L
NaAc 40 mmol/L
EDTA 5 mmol/L
四、实验步骤
（一） 总RNA的提取（方案一）
1. 实验前10天左右播种水稻种子，在3-4叶期，剪取1.2 g幼叶。放入研钵，在液氮中研磨成粉末状，移入10 mL离心管。加入
4 mol/L异硫氰酸胍 4 mL
苯酚 3 mL
2 mol/L NaAc (pH 4.8) 0.3 mL
氯仿 0.6 mL
混匀，冰浴放置30 min。
2. 4℃，8000 r/min，离心13 min。
3. 弃沉淀，取上清至另一干净无菌离心管中。
4. 加入2倍体积无水乙醇，-70℃，0.5 h。
5. 4℃，8000 r/min，离心13 min。
6. 弃上清，在沉淀中加入1 mL 4 mol/L LiCl，使其溶解。
7. 移入1.5 mL离心管中，冰浴2 h。
8. 4℃，13000 r/min，离心15 min。
9. 弃上清，在沉淀中加入400 uL DEPC水，再加入400 uL氯仿，混匀。
10. 4℃，13000 r/min，离心6 min。
11. 取上清，并加入1/10体积3 mol/L NaAc（pH 5.0），2倍体积无水乙醇，-20℃，放置 30 min。
12. 4℃，13000 r/min，离心20 min。
13. 将沉淀RNA用70%乙醇洗涤2次。
14. 将沉淀RNA室温下稍干燥。
15. 加30 uL DEPC水溶解，-70℃保存。
（二） 总RNA的提取（方案二）
利用TRIzol提取液抽提RNA，具体步骤如下：
1. 取幼叶约250 mg在液氮中研磨至细粉，转入预冷的1.5 ml离心管；
2. 加入1 ml TRIZOL提取液震荡摇匀；
3. 室温放置5 min后，加入0.5 ml的氯仿，剧烈摇动离心管5 min；
4. 在 8℃条件下，12000 rpm离心15 min；
5. 溶液分为两层，下层为酚－氯仿浅红色液层，将上层液体移入干净离心管， 加入 0.5 ml异丙醇在15~30℃条件下，沉淀10 min；
6. 然后在, 2~8℃条件下，12000 rpm离心10 min，RNA沉淀管壁和底部；
7. 去掉液体部分，加入1 ml 75%酒精洗2次；
8. 风干后，加入25 µl DEPC处理过的水溶解 RNA，储藏于-80℃冰箱备用。
（三）甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA
1．配制1.2%变性琼脂糖凝胶 (40 mL)
称取0.48 g,加入DEPC水25.2 mL,5X电泳缓冲液4 mL, 加热使溶解，稍冷却加入甲醛 3.4 mL, 混匀，室温凝固0.5-1 h.
2. RNA电泳检测样品制备
RNA | 2 μl |
甲醛 | 2.5 μl |
甲酰胺 | 7.5 μl |
10×MOPS | 2 μl |
RNA Loading Buffer | 2 μl |
灭菌的DEPC 水 | 4 μl |
混合液轻轻混匀并离心，放于65℃下温育 5 min后，置于冰上。
3. 电泳检测
将1.2%变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加 1×MOPS电泳缓冲液，覆盖凝胶约1 mm。将RNA样品加到凝胶点样孔中，在5 V/cm条件下电泳30 min，然后在EB中染色 15-20 min，在紫外灯下观察提取的RNA的质量。
五、注意事项
1．在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。
2．RNA 酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套，并注意时刻换新手套。
