海带叶绿素含量的测定方法
叶绿素是自然界生物光合作用的产物，它无毒可食用，所以广泛应用于食品、化装 品、药物的着色，另外，在生化研究中也有非常重要的作用，故叶绿素的需要量很大，我国每年出口约1000t。目前叶绿素的生产，人们把精力主要集中在植物 叶或以叶绿素含量较高的蚕沙上，但这要受到季节的影响，而且有些树叶含有难以分离的毒素，且陆生植物叶子中叶绿素含量约为0.3%-0.5%。为了扩大叶 绿素的生产，发掘新的生产原料，我们把目光转向了海洋。
众所周知，海洋中的海藻和陆地植物一样，也是通过光合作用来使光能转变为化学能并维持自身生长的，由于水中可被利用的光能比陆地上少得多，要完成能量的转换，必须增加参与光合作用的叶绿素的含量。所以，一般来说，海洋植物中叶绿素和其他辅 助色素的含量高于陆生植物，而且海洋植物的生长快、产量大，故研究利用海洋植物来提取叶绿素对海洋资源的综合开发、天然色素的提取，都具有非常重大和深远 的意义。为此，我们选用海带为原料，进行叶绿素提取的研究。
1.材料和方法
1.1材料：浙江温岭海带养殖场提供海带干品
1.2仪器721型分光光度计、叶绿素检测仪、pH计、电热恒温水浴、电子称、架盘天平、微型植物试样粉碎机。
1.3试剂
石油醚、95%乙醇、95%丙酮、氢氧化钠、硫酸铜、丙酮乙醇混合液（按体积比95:5配制）
1.4工艺流程
海带→粉碎→加水洗净→糊状海带→硫酸铜处理→洗涤干燥→浸提→提纯→浓缩→皂化→干燥→产品
1.5测定方法
1.5.1吸光度值（OD）的测定：用721型分光光度计测定，根据吸光度值和变化情况加以分析，根据吸光度值来确定和选择最优条件。
1.5.2产品质量分析：根据《食品添加剂手册》P314-315测定。
1.5.3pH值：用酸度计测定。
1.5.4粗产品率：X%=W2/W1×100
W1-指海带经复水后机械脱水，并用滤纸吸干表面水分后的重量（g）
w2-指最终得到的叶绿素铜钠粗品的重量（g）
2.结果与讨论
2.1原料的预处理
2.1.1粉碎色素多含在细胞或填充在细胞腔的一些细胞组织中，粉碎在一定程度上破坏原料的细胞壁组织，除去色素向溶剂扩散的主要障碍，从而加速溶剂渗人和色素溶解并扩散的过程。
2.1.2冷水洗涤可除去泥沙和杂质，且在洗涤过程中可把海带表层附着的甘露醇沉下来。所以，洗涤液中可提取甘露醇。
2.1.3热水浸泡冷水洗净后的海带还有一些溶于温水的不利于色素提取的物质，如海藻素等，用40-50℃温水浸泡除去这些物质。海带与温水比例为1:4,每次浸泡10-15而n,二次为宜。
2.1.4硫酸铜处理叶绿素分子中的吨被Cu取代，生成的绿色盐更加稳定，它耐光性强，不易被蛋白质取代，还可减少叶黄素和类胡萝卜素对浸提和提纯的影 响。色素分布于植物组织细胞质内，铜盐渗人其中需要一定时间，因此，不同的处理时间对色素提取有着不同的影响。实验用5%CuS仪溶液浸泡海带进行处理。
2.1.5洗涤，脱水硫酸铜处理结束后，先洗涤除去甘露醇铜沉淀物和硫酸铜。干海带经上述操作后吸附了大量的水，水的存在会影响浸提率和浸提速度，所以，先机械脱水，然后用滤纸吸附，以减少水对浸提的影响。
2.2浸提
2.2.1最大吸收峰γ的测定海带处理13h后，加人丙酮乙醇混合液，料液比为1:50。在25℃的恒温槽中浸提2h,过滤所得浸提液，并定容，用721分光光度计在380~680nm波长范围内扫描，取三次测定平均值作图，见图1。
图1 波长与OD值关系图
由图 1可知，在410nm和660nm二个波长下叶绿素铜盐有二个最大吸收峰。绿色由紫色和红色混合而成。410nm处于紫光区（400-435nm），由于在浸提过程没有除杂，因此浸提液中杂质的含量较高，如蛋白质，叶黄素，类胡萝卜素等，而这些杂质的最大吸收峰接近410nm,因此实验中应以仅660nm 的OD值为准。
2.2.2硫酸铜处理时间的确定
表1硫酸铜处理时间对浸提的影响
结果表明，硫酸铜处理时间以13h为好。
2.2.3浸提溶剂的选择
表2不同溶剂对得率的影响
由表2可知，以95%的丙酮浸提效果最佳，但用丙酮浸提时，在浓缩成糊末产品时，有丙酮残留在产品中，作为食品添加剂是不允许的。而用丙酮乙醇混合液浸提，其浸提率和丙酮浸提相差不大，同时浓缩回收时，残留在产品中的乙醇对人体影响不大，所以选择用丙酮乙醇混合液提取。
2.2.4浸提时间的选择
表3浸提时间和得率的关系
可见浸提时间以2h为好。
2.2.5浸提温度的确定
表4浸提温度的影响
结果表明，60℃为宜，升高温度能提高色素的浸出率，提高得率，但温度过高影响色素的稳定性。
综上所述，提取的最佳条件是：原料用5%CuSO4处理13h,用50倍丙酮乙醇混合液于60℃浸提2h。
2.3浓缩、皂化、干燥将上述所得到的提取液装人分液漏斗中，加入三分之一体积的石油醚震荡2而n,静置分层，下层水相是叶绿素铜盐液，上层油相是叶黄素、叶酸等杂质。取下层液，用5%Na0H调节pH=11,装人烧瓶，接通冷凝器，在水浴锅上加热回流lh进行皂化，然后回收丙酮，浓缩产品，随着丙酮量 的减少，可适当提高温度回收丙酮，一般温度不超过70℃，至不能回收丙酮时为止。把浓缩液移人烤盘中，放人印℃恒温干燥箱中干燥，得到墨绿色块状产品，碾 磨成粉末，即得叶绿素铜钠盐粗品，避光保存。测得平均得率为5.03%。
3.产品性能试验
3.1产品为墨绿色粉末，易吸潮，易溶于水，水溶液绿色透明，略溶于乙醇和丙酮，有钙离子存在时，则有沉淀析出。
3.2取试样作焰色试验，当试样溶液的浓度较高时，可明显观察到火焰开始呈绿色，后呈黄色。
3.3pH值用蒸馏水配制成1%溶液，其pH值为9.70。
3.4吸收峰取试样0.1g配成100ml水溶液，在380nm-660nm波长范围内扫描，此溶液最大吸收峰为405和630nm,消光值之比E405/E630=0.686/0.178=3.85,符合标准要求。
