肠道病毒EV71 TaqMan荧光定量RT PCR法快速检测
肠道病毒(EV)属于小RNA病毒科，根据血清学可以分为脊灰病毒、柯萨奇、埃可病毒和肠道病毒68～71型，共67个血清型。肠道病毒可引发众多疾病，并可暴发流行，导致死亡，严重危害人类健康。浙江省近几年由肠道病毒引起的无菌性脑炎〔1，2〕、手足口病〔3〕、急性出血性结膜炎和新生儿急性心肌炎等暴发疫情频频发生。为了迅速查明病因，及时采取控制措施，亟需进行实验室快速诊断，但肠道病毒传统的检测方法是病毒分离和中和法定型，不仅繁琐费时，而且无法对所有的血清型进行鉴定，更不能对一些抗原变异株或新型别毒株进行鉴定。本研究建立的肠道病毒荧光定量RTPCR方法，为肠道病毒实验室应急检测提供了有效的分子生物学检测手段。
1.材料与方法:
1.1 病毒标准株与临床标本 脊髓灰质炎病毒Sabin Ⅰ～Ⅲ型疫苗株(北京生物制品研究所);柯萨奇、埃可和肠道病毒70～71型等标准株(中国医学科学院);麻疹、风疹、腮腺炎、乙型脑炎等毒株(中国疾病预防控制中心)。临床样本来源于浙江省近几年各地报告的疑似肠道病毒感染疫情如无菌性脑炎、手足口病、疑似脊髓灰质炎和急性出血性结膜炎等患者的脑脊液、疱疹液、粪便和眼拭子等，样本采集后常规送至实验室。
1.2 引物与探针 从GenBank上下载不同年份和地区的肠道病毒基因序列，用生物学软件进行同源性比较，在5′非编码保守区设计特异性引物和TaqMan探针，序列为EVF：5′CTGYRGCGGAACCGACTAC3′;EVR：5′ATTGTCACCATAAGCAGCCA3′;EVProbe：5′FAMTTGGGTGTCCGTGTTTMGB3′。引物和探针委托上海基康生物工程有限公司合成。
1.3 病毒定量标准与病毒RNA的提取 以Sabin Ⅲ型疫苗株为标准毒株，用人横纹肌瘤细胞(RD)进行病毒效价滴定(107，5TCID50/ml)后作为参考株，将其稀释TCID50分别为1000，100，10，1，01，001于每个反应管。病毒RNA的提取按试剂盒说明书(德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit)。
1.4 荧光RT-PCR反应体系和条件的优化 试验在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从100～900μmol/μl，探针浓度从50～300μmol/μl,采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，在60℃进行单点荧光检测，根据荧光RT-PCR反应的最低荧光阈值(Ct值)和最高荧光强度增加值(△Rn)选择最佳引物和探针浓度。试剂盒采用(AKARA公司)荧光RT-PCR Kit，按试剂盒说明书操作。
1.5 RTPCR反应 肠道病毒RT-PCR通用引物参照文献〔4〕，EV1：5′AAGCACTTCTGTTTCCC3′(166-182)，EV2：5′ATTCAGGGGCCGGAGGA3′(447463)，扩增片断297bp。采用RTPCR试剂盒(美国Roche公司)进行扩增，反应体系为20μl。其中5×RTPCR缓冲液4μl，4种脱氧核苷酸(dNTP)混合物(10mmol/L)16μl二硫疏糖醇(DTT)(100mmol/L)10μl,RNase抑制剂(5u/μl)04μl，20μmol/L上游引物与下游引物各0.5 μl，Taq酶和逆转录酶混合物(5u/μl)04μl，模板RNA 10μl，最后用焦碳酸二乙脂(DEPC)水补足至20μl。反应条件为50℃ 30min，94℃ 2min进行逆转录和变性，然后94℃ 30s，55℃ 30s，68℃ 1min进行扩增，35个循环后转入68℃ 7min，取8μl产物电泳后判断有无特异性条带。
1.6 荧光RTPCR特异性、敏感性和重复性试验 选择肠道病毒：脊髓灰质炎病毒Ⅰ～Ⅲ型，柯萨奇病毒A16,A24，B1，B3，B5,埃可病毒7，20，30型和肠道病毒71型，以及选择容易引起脑炎等症状的非肠道病毒，麻疹、风疹、腮腺炎、乙脑、登革热病毒等，对上述2组病毒分别提取核酸，用肠道病毒荧光RTPCR方法进行检测，验证方法的特异性。对已标定TCID50的肠道病毒Sab in Ⅲ型(107，5TCID50/ml)稀释后分别提取RNA，平行进行荧光RTPCR与RTPCR反应，比较其灵敏度。此外，对每一个浓度的病毒稀释液作5次重复检测，得到的Ct值采用stata80软件计算标准差，验证方法的重复性。
1.7 统计分析 荧光RTPCR法的Ct值采用Stata80软件计算其±s
2 结果
2.1 荧光RTPCR反应体系及条件 采用一步法荧光RTPCR试剂盒，总反应体系为25μl。矩阵法优选后引物最佳浓度均为064μmol/L，探针最佳浓度为0.30μmol/L，模板RNA 10μ1，最后用DEPC水补至25μl。用MJ Research Option 2荧光检测系统或Roche Lightcycle荧光检测系统进行检测，反应参数为：45℃ 30min逆转录，94℃变性2?min，以93℃ 15s，60℃ 1min扩增40个循环，在60℃进行单点荧光检测，可获得最低Ct值和最高荧光强度。
2.2 特异性试验 本研究建立的荧光RTPCR方法对肠道病毒具有较好的特异性，可检测PVl-3，Cox A16、A24、Bl、B3、B5，ECH07、20、30，EV70～71型等不同群的肠道病毒，而与腮腺炎、乙脑、登革热、麻疹、风疹病毒等均无交叉反应。
2.3 敏感性试验 对肠道病毒Sabin Ⅲ型疫苗株，采用RD细胞进行病毒效价测定(107，5TCID50/ml)，然后稀释成1000，100，10，1，0.1，0.01 TCID50，提取病毒RNA，分别用荧光RT-PCR与常规RT-PCR方法进行检测，结果荧光RT-PCR方法检测敏感性达到0.1 TCID50，比常规RT-PCR方法的灵敏度1.0 TCID50高10倍左右。
A～E：1000，100，10，1，0.1 TCID50
图1 荧光PT-PCR法检测肠道病毒的灵敏度(略)
2.4 重复性试验 肠道病毒Sabin Ⅲ型疫苗株按10倍梯度稀释成4个不同的浓度，对每一个浓度的样本作5个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.23～0.65之间，具有较好的重复性。
表1 荧光RT-PCR法检测肠道病毒核酸的重复性试验(略)
2.5 样本的检测 从浙江省各地报告的病毒性脑炎、手足口病、急性出血性结膜炎和急性心肌炎等等疑似肠道病毒感染疫情患者的脑脊液23份、粪便20份、疱疹液8份和眼拭子7份等临床样本中直接提取病毒RNA，用建立的荧光RT-PCR方法检测肠道病毒核酸。结果显示，58份样本中肠道病毒核酸阳性的有32份。同时对上述样本采用RD和Hep-2细胞进行肠道病毒分离，结果病毒分离阳性的24份，其余8份荧光RTPCR方法阳性而病毒分离阴性的样本，采用肠道病毒通用引物直接从样本中提取病毒核酸后进行1次或2次RTPCR扩增相应片段、测序和BLAST比对，最终确定为肠道病毒。
3 讨论
肠道病毒是最常见感染人类的病毒，可导致多种疾病，临床表现多样，近几年由肠道病毒引起的暴发疫情时有发生〔1-3,5〕。对该类疫情尽早作出实验室确诊是及时采取防控措施与对症治疗的关键。近几年发展起来的以特异性荧光探针为特点的荧光定量PCR技术，实行完全闭管式操作，不仅能大大减少扩增产物污染的机会，而且较常规RTPCR技术，无诊从敏感性、特异性与速度上都更具有优势，当然它对引物和探针的设计也提出了更高的要求〔6-8〕。我们从美国的NCBI与日本的DDBJ基因库上下载了近20年来世界各地的肠道病毒株，对其进行了同源性比较，在肠道病毒5′端非编码区设计若干对引物与Taqman探针，对该区域进行特异性扩增，从中筛选出最佳的引物和探针，并对荧光RT-PC方法进行优化，验证其敏感性、特异性和重复性。经肠道病毒标准株与临床样本的检测比较，该方法具有高特异性，能检测脊髓灰质炎病毒Ⅰ～Ⅲ型、柯萨奇病毒Bl、B3、B5，埃可病毒7、20、30型及新型肠道病毒70～71型等多个血清型别的肠道病毒，与腮腺炎、麻疹、风疹、乙脑、登革热病毒均无交叉反应，而且比常规RTPCR和病毒分离法更敏感、快速和简便。通常肠道病毒的RTPCR检测敏感度在1.0 TCID50左右，从病毒核酸提取、RTPCR反应与电泳，整个过程大约需6～7h左右，而采用本方法从核酸提取至完成检测，仅需3h左右，能同时完成多个疑似患者临床样本的高通量检测，敏感度达0 . 1 TCID50，比普通PCR的灵敏度高10倍左右，可直接从无菌性脑炎、手足口病、急性出血性结膜炎患者的脑脊液、粪便、疱疹液和眼拭子等临床样本中检测肠道病毒核酸，而且核酸阳性的样本被肠道病毒分离和基因测序的结果得到进一步的证实。我们用建立的新方法，对近几年我省疑似肠道病毒感染引起的应急疫情进行实验室早期快速诊断，获得了令人满意的结果。
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