阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒使用说明
阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒（一管式PCR-荧光探针法）
◆ 产品说明
阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）参照《SN/T 1870—2016 进出口食品中食源性致病菌检测方法 实时荧光PCR法》进行设计，可针对食品样品中阪崎克罗诺杆菌（阪崎肠杆菌）的特异核酸片段进行扩增，通过实时扩增曲线判定结果。该产品检出限为10^3 cfu/ml（使用071021M细菌基因组DNA提取试剂盒提取1 ml 10^3cfu/ml增菌液的细菌基因组DNA作为模板）。
◆ 产品组成（ 96测试）
011122LⅡ | |
试剂 | 含量 |
A-ES-P | 20μL × 8管×12排 |
NG-P | 100μl×3支 |
PG-ES-P | 100μl×2支 |
◆ 适用仪器
荧光PCR仪（如ABI 7500）等可配套0.1 mlPCR八联管的PCR扩增仪。
◆ 自备耗材和仪器
①灭菌1.5mL或2.0mL离心管；③冰盒；④移液器（1-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；⑤离心机；⑥涡旋混匀器；⑦金属浴；⑧均质机、搅拌机或研钵等研磨器具；⑨电子天平。
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1）第一区：试剂准备区。
2）第二区：样本制备区。
3）第三区：扩增及产物分析区。
★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2. 实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，使用移液器，实验产生的所有废弃物及时处理。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前剪下所需的测试数，解冻后使用前离心30秒。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
◆ 样品处理
参照《GB 4789.40-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验》进行阪崎克罗诺杆菌的样品制备、增菌培养和分离。
◆ 实验操作
1. 模板制备（样本制备区）
建议使用试剂配套细菌组DNA提取系列产品，具体过程详见产品说明书。
2．添加模板（样本制备区，放置于冰盒中进行）
剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管，放置在室温待解冻后，离心30秒后揭开封口膜，使用穿刺加样法穿过固封层向每管反应液中分别加入5μL模板，顺序为NG、待测样品模板、PG-ES-P。盖好配套的PCR管盖后，涡旋混匀30s，离心1min，立即进行PCR扩增反应。
3. 扩增反应（扩增及产物分析区）
使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择TAMRA。
按下列条件设置扩增反应：
PCR循环 | 荧光收集位点 | ||
95℃ | 3分钟 | 1个循环 | — |
94℃ | 5秒 | 40个循环 | — |
60℃ | 40秒 | ※ |
4.基线和阈值设定
基线调整取3-15个循环的荧光信号，阈值线应超过阴性对照扩增曲线的最高点。
◆ 结果判定
检测样品无Ct≥40，可报告样品阴性，不含有阪崎肠杆菌或含量低于检测限；
检测样品Ct ≤35，曲线呈“S”型扩增曲线，可直接报告样品阳性，含有阪崎肠杆菌。
检测样品35＜Ct＜40，建议重复实验。重复结果Ct≥40则样品为阴性，否则为阳性。
NG反应为平滑直线，PG反应为“S”型扩增曲线且Ct值＜30，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。
