分子杂交——Southern基因检测
实验概要
将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替Southern 杂交。但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。
主要试剂
１．0.25M的HCl：21.55ml浓盐酸定容至1000ml。
２．0.4M NaOH。16g NaOH溶于800ml蒸馏水，定容至1000ml。
3. 10% SDS：10g SDS溶于80ml蒸馏水，定容至100ml。
4．20×SSC: NaCl 175.3g、柠檬酸三钠88.2g，加ddH2O至800ml，用2N NaOH调pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC处理、高压灭菌。
5．50×Denhardt : 聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加dd H2O至50ml,无菌抽滤、分装。
6．1M Na2HPO4: Na2HPO4•12H2O 35.81g, 加dd H2O至100ml。
7. 1M NaH2PO4: NaH2PO4•2H2O 15.6g, 加dd H2O至100ml。
8. 0.1M 磷酸钠缓冲液(pH 6.6): Na2HPO4 35.2ml加NaH2PO4 64.8ml 。
9.预杂交液: 20×SSC 5ml,甲酰胺10ml,50×Denhardt 4ml,1M磷酸钠缓冲液0.2ml（pH6.6）,10%SDS 1ml, 总体积 20ml。临用前加入变性鲑鱼精DNA（10mg/ml）,使终浓度为4μl/ml。
实验步骤
1、基因组DNA的制备
2、基因组DNA的限制酶切
根据实验目的决定酶切DNA的量。一般Southern杂交每一个电泳通道需要5-10μg的DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。消化的DNA浓度不宜太高，以0.5μg /μl 为好。由于内切酶是保存在50%甘油内的，而酶只有在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用，所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10。
具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入
DNA（1μg /μl） 5 μg
10×酶切buffer 5.0 μl
限制性内切酶（10U/μl） 5.0 μl
加ddH2O 至 500 μl
在最适温度下消化24-30hr。消化结束时可取1μl电泳检测消化效果。如果消化效果不好，可以延长消化时间，或者放大反应体积，或者补充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活力下降及溶解蛋白质的污染。
消化后的DNA加入1/10体积 3M的NaAC，2倍体积乙醇沉淀，超纯水溶解（离心转速要提高到12000g，以防止小片段DNA的丢失）。
如果需要两种酶消化DNA，而两种酶的反应条件可以一致，则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致，则先用需要低离子强度的酶消化，然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度，再加第二种酶进行消化。
3、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法，制备简单，分离范围广（200bp-50kb），实验成本低。下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DNA片段范围。 一般用1%的TAE或者是0.5%的TBE作为电泳缓冲液。
表：不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围
琼脂糖凝胶浓度（%） 分离DNA片段范围（kb） |
0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 |
（1）. 制备0.8%凝胶：一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%的。
（2）. 电泳：电泳样品中加入6×Loading 缓冲液，混匀后上样，留一或两泳道加DNA Marker。1-2V/cm，DNA从负极泳向正极。25v过夜电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时，停止电泳。取出凝胶，紫外灯下观察电泳效果。在胶的一边放置一把刻度尺，拍摄照片。正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带，照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置，以确定被杂交的DNA长度。
4、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物
转移就是将琼脂糖凝胶中的DNA 转移到硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜上，形成固相DNA。转移的目的是使固相DNA与液相的探针进行杂交。常用的转移方法有盐桥法、真空法和电转移法。这里介绍经典的盐桥法（又称为毛细管法）。
（1）试剂准备
a．脱嘌呤：0.25M的HCl。
b．变性液：0.4M NaOH。
c．转移液：0.4M NaOH
（2）操作步骤
a.脱嘌呤:将凝胶转移到0.25M的HCl 直到前沿溴芬蓝变黄。
b.碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中到溴芬蓝恢复蓝色。
c转移：按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记，浸入转移液中5min。剪一张比膜稍宽的长条Whatman 3mm滤纸作为盐桥，再按凝胶的尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用。（ 为了保证转移完全，转移过程一般需要2天左右，每隔数hr换掉已经湿掉的纸巾。转移液用0.4M NaOH。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。）
d. 转移结束后取出NC膜，浸入2×SSC溶液数min，洗去膜上沾染的凝胶颗粒，包上保鲜膜，紫外下交连3min，然后置与-20℃保存。
5、探针标记
进行Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。这里介绍放射性标记。
探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，有一些试剂盒可供选择，操作也很简单。
以下是Promega公司的Prime-a-Gene Labeling System：
（1）取模板DNA 25ng于0.5ml离心管中，95-100℃变性5min，冰浴5min。
（2） dNTPmix的制备: 取dGTP 1μl、dATP 1μl、dTTP 1μl混匀。
（3）将下列反应成份混合，加入上述微量离心管中：
dNTPmix 2.0μl
BSA(10mg/ml ) 2.0μl
5×buffer 10.0μl
Klenow 酶(5u/μl) 1.0μl
α-32P-dCTP 5.0μl
加入适量dd H2O使反应总体积达50μl，轻轻混匀。室温下反应1hr。
6、杂交
Southern 杂交一般采取的是液-固杂交方式，即探针为液相，被杂交DNA为固相。杂交发生于一定条件的溶液（杂交液）中并需要一定的温度，可以用杂交瓶或杂交袋并使液体不断的在膜上流动。杂交液可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。下面给出的为一杂交液配方：
6×SSC，0.5%的SDS，5×Denhandt试剂。该杂交液的杂交温度为65℃。
（1）.预杂交
在杂交瓶中加入杂交液（200px×8 cm的膜加5ml即可），将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液。放入65℃杂交炉中，使杂交体系升到65℃。取经超声粉碎的鲑鱼精DNA（已溶解在水或TE中）100℃加热变性5min，迅速加到杂交瓶中，使其浓度达到100μg/ml。过夜杂交。鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点，降低杂交背景、提高杂交特异性。
（2）．杂交
将变性的探针（95-100℃变性5min，冰浴5min）迅速加到杂交瓶中。65℃杂交过夜。
7、洗膜与检测
取出NC膜，按照下列条件洗膜：
2×SSC/0.1% SDS，65℃，10min；
1×SSC/0.1% SDS，65℃，10min；中间5分钟的时候检测放射强度确定下一步时间。
0.5×SSC/0.1% SDS，65℃，10min；
在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。洗完的膜用保鲜膜包裹，注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。将膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏），在暗室的红光下，贴覆两张X光片，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒，置-70℃低温冰箱中曝光。根据信号强弱决定曝光时间，一般在1周左右。洗片时，先洗一张X光片，若感光偏弱，则再多加两天曝光时间，再洗第二张片子。
影响Southern杂交实验的因素很多，主要有：DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。
注意事项
（1）. 不可用手触摸NC膜，否则影响DNA的转移及与膜的结合。
（2）. 转移时，凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严，防止在转移过程中产生短路，影响转移效率，同时注意NC膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡，以免影响转移。
（3）. 注意同位素的安全使用。
