成人小肠类器官的培养与分化操作指南
2011年，Hans Clevers等首先报道了成人小肠类器官的构建方法，人小肠类器官分别具有小肠上皮组织隐窝和绒毛区域细胞的特征，小肠类器官与小肠上皮组织在细胞组成和形态结构上高度相似，并具有良好的短狀吸收和离子转运功能。人小肠类器官的培养条件与小鼠小肠类器官不同，除了加入基本生长因子外(EGF, Noggin，R-Spondin-1, Wnt-3a)，还需要添加一些激素和维生素类物质，如胃泌素(gastrin)和烟酰胺(Nicotinamide)，可以延长类器官的存活时间，另外加入A83- 01和SB202190，可以抑制类器官的死亡，提高类器官形成率。在这样的培养条件下，人小肠类器官呈现出芽状结构，增殖的干细胞处于出芽部位，小肠类器官经过传代培养，可以存活6个月以上，并且可以保持基因型不变。以上培养条件可用于人类肠道类器官的长期培养与扩增，但却不能像小鼠类器官那样可以分化为各种肠上皮细胞，在上述培养条件的基础上去除Wnt3A、Nicotinamide和SB202190，同时加入DAPT小分子，则可以诱导肠干细胞分化为各种终末分化结肠上皮细胞。人小肠类器官模型的建立，有望推动小肠生理与疾病基础研究的发展并且在药物开发、个体化治疗、基因治疗以及再生医学等方面具有巨大的应用前景。
◆成人小肠类器官的制备◆
1. 肠道手术或肠镜活检取得的正常肠组织标本保存于4 ℃的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液(DPBS)中运输，用4 ℃含青霉素和链霉素的DPBS反复冲洗标本至洗涤液澄清。
2. 用镊子轻刮标本黏膜面去除黏液，将小肠组织标本转移至盛10cｍ细胞培养皿上，加入一定量的DPBS。
3. 使用灭菌弯尖眼科剪，将组织标本剪碎，直至组织块直径小于１ｍｍ,使用预冷1%BSA溶液润洗移液管管壁后，将组织块转移至15ml离心管中。待组织块沉淀后，吸除上清液，加入10ml预冷DPBS, 重悬8-10次。按上述方法漂洗 3-5次，直至上清变澄清。
4. 去除上述澄清液。加入3ml解离缓冲液，使用预冷1%BSA溶液润洗移液管管壁后，将重悬液转移至 6孔细胞培养板中，并加入300ulEDTA(50mM)。冰上震荡消化30min左右，直至大部分隐窝游离。在显微镜下观察，游离的隐窝呈＂腊肠样＂，隐窝原所在位置呈＂甜甜圈样。
小肠隐窝消化液：2-5mM的EDTA, 此步骤后可以让组织碎片自然沉降后去除上清，继续消化一次
5. 收集消化后的溶液，让组织碎片通过重力沉降约1min。小心吸出并丢弃消化液，留下足够的液体以没过组织碎片。
6. 将组织碎片重悬于预冷的解离缓冲液，并用移液管上下吹打三次。静置直到大部分肠组织碎片沉降到底部。
7. 小心吸取上清液并使用70μm滤网过滤，将滤液收集于干净的50mL管中。
8. 重复上述6-7步骤几次，直至上清中没有隐窝，将几次获得上清收集在一起。
9. 在2-8℃下将上述收集的上清以200×g离心3分钟。小心地倒出并丢弃上清液。
10. 将沉淀重悬于含有10mL解离缓冲液中。200×g离心3分钟。轻轻倒出上清液。将肠隐窝沉淀留在管中。根据沉淀量加入适当体积的基础培养基重悬沉淀，如果单细胞过多，可再次离心，收集上清以去除单细胞。
11. 计数，吸取10μL置于玻璃载玻片或血细胞计数器上。使用倒置显微镜，计数10μL样本中的隐窝数量，200g离心5min，小心吸出并弃去上清。
12.用类器官培养基将隐窝的密度重悬至8-20个/ul，取出150ul隐窝悬液，加入等体积的未稀释的基质胶混合隐窝，小心地上下吹打十次以充分混匀，注意避免产生气泡。
13. 吸取50μL悬液，加入到提前预热的24孔板每个孔中的中心部位，样品应在每个孔的中心形成圆顶结构。为了防止接种时出现气泡，枪头内液体不要全部打出。
14. 将培养板在37°C下静置10分钟以待基质胶完全凝固。将平板转放入培养箱时，应注意不要破坏凝固后的液滴。
15. 使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入500μL室温(15-25℃)的配制的类器官扩增培养基。不要将培养基从圆顶结构上直接加入。
16. 向其它未接种的孔中加入无菌PBS以保证培养时的湿度。 将培养板的盖子盖好，并在37℃和5％CO2下进行培养。
17. 隔天进行完全换液。换液时将移液枪头放在孔底边缘小心地将原有液体培养基吸出，并加入为500μL新鲜的室温类器官培养基。
18. 对于原代培养物，7-14天进行传代，对于已经传代的类器官，每7-10天传代一次，以1：3~1：5的比例进行类器官传代，以避免在类器官过度生长和空腔内积累过量的碎屑。
操作要点
❶ 镊子轻刮标本黏膜面去除黏液，否则后续得到的分馏会有很多杂细胞污染。
❷ 使用移液管(枪头)前用1%BSA溶液提取润洗，这样可以减少隐窝吸附在移液管(枪头)上，1%BSA可用DMEM培养基配制。
❸ 小肠隐窝消化液用5mM的EDTA，注意EDTA是否有析出，如析出太多会影响终浓度，有必要更换新的EDTA。
❹ 因分离小肠隐窝需要时间较久，建议整个操作在低温进行，离心机调至4℃，所用试剂溶液放冰上预冷。
❺ EDTA消化后，小肠组织会变松散，在外界机械力作用下，小肠隐窝会从组织中分离出来，可以重复几次通过外界机械力作用得到不同的分馏组分混合，也可以挑选隐窝含量较高，杂细胞较少的分馏组分种板培养。
❻ 得到分馏组分后进行隐窝计数，用完全培养基重悬隐窝至8~20个/μl，加入等体积基质胶混合，该过程一定要在冰上操作，混合过程切勿产生气泡，否则影响后续观察以及隐窝培养状态，混匀过程可以调小量程，吸取的液体不要全部吹出。
❼ 购买的基质胶在冰上融化后分装冻存，操作过程中基质胶一定要放在冰上，未用完的液体状基质胶可以冻存，若凝固后请弃去。
◆成人小肠类器官的传代培养◆
1. 在成熟类器官的24孔板中，每孔加入约1ml预冷的细胞回收液，用1ml枪头吹打板底的基质胶，直到基质胶全部打碎，收集每个孔中的悬液置于15 ml离心管中；
2. 将全部打碎的基质胶悬液冰上震荡消化10min；可用1ml大枪头继续吹打悬液，此过程避免产生气泡(调制量程到700ul可避免气泡产生)，可取适量的悬液观察，直至看不到大块的类器官团块为止。
3. 加入10ml预冷的1%BSA溶液进行洗涤，离心弃去上清后用基质胶重悬。基质胶铺板后加入含有Y-27632的小肠类器官扩增培养基。
4. 传代中，若隐窝状态良好可进行1：3传代，若状态较差可进行1：1传代。全程可以维持约6个月的长期传代扩增，且类器官状态保持良好。
◆成人小肠类器官的冻存与复苏◆
准备冻存液：10％二甲基亚砜(DMSO)+20％胎牛血清(FBS)+70％DMEM/F12。
1. 将需要冻存的类器官冰上放置5～10 min。
2. 收集类器官，步骤同之前传代收集步骤一致。
3. 离心后弃上清，用800ul的冻存培养液重悬，将悬液移至冻存管中，放入冻存盒中于-80℃冰箱中保存24 h，如需长久保存，则24 h后转移至液氮罐保存。
复苏准备：37℃水浴箱
从液氮中取出冻存管后,立即放入37℃水浴中,使之迅速融解。等到冻存管中仅存一小片冰室,迅速将细胞转移到含9ml冷的基础培养基中(先将之置于15ml离心管中,放于冰上)。200g
室温离心5min,弃去上清,加入适量类器官培基重悬后与基质胶混合种板,加入含有Y-27632的小肠类器官扩增培养基。
◆配制小肠类器官扩增培养基◆
*扩增培养基可以用于人类肠道类器官的长期培养与扩增，但却不能像小鼠类器官那样可以分化为各种肠上皮细胞！
基础培养基：将青-链霉素( 1%) 、10mM HEPES、L-谷氨酰胺( 1%)加入至DMEM/F-12 培养基，第一次种板需要加入Y-27632，后续换液不需要加入Y-27632。
◆配制小肠类器官分化培养基◆
分化培养基在扩增培养基的基础上去除了WNT-3a，SB2020190，Nicotinamide，加入了DAPT。
