荧光分光光度计基本原理
一、荧光的产生
构成物质的分子中存在电子，一般情况下电子总处在能量最低的能级(基态)，分子中同一轨道中的两个电子白旋方向相反，净电子自旋为0，以S=0表示，此时称分子处于单重态，基态单重态以S1表示；分子吸收能量后受激的电子跃迁进入较高能级，若在跃迁过程中电子的自旋方向不改变，此时认为分子处于激发的单重态，可表示为第一激发单重态(S1)、第二激发单重态(S2)……；若在跃迁过程中伴随着电子的自旋方向发生改变，此时分子中出现两个自旋状态相同的电子，以S=1表示，认为分子处于激发的三重态，以符号T表示，第一、第二激发三重态分别以T1、T2……表示。
基态电子吸收能量跃迁到较高能级的过程称之为激发，处于激发态的电子不稳定，总具有跃迁回到基态、伴随释放能量的趋势。跃迁方式主要有辐射跃迁和非辐射跃迁等。当以辐射方式跃迁时，能量转化为相应的波长的光，这个过程即为发射，跃迁到激发态的电子大多处于单重激发态。如果电子直接从第一激发单重态的最低能级以辐射方式跃迁回到基态，这种发射光称之为荧光，其寿命较短；若激发态电子弛豫到三重态，再以辐射方式跃迂回到基态，这种发射光称之为磷光，其寿命相对较长。
二、激发光谱与发射光谱
荧光是一种光致发光现象。只有选择合适波长的激发光，才可能得到合适的荧光光谱。若固定测量波长为荧光的最大发射波长，改变激发波长并记录相应的荧光强度，根据所测得的荧光强度与激发光波长的关系即可绘制出激发光谱曲线。在激发光谱图上的荧光强度最大处所对应的激发波长即为最大激发波长A。。。在最大激发波长的光照射下，处于激发态的分子数目最多，物质吸收的光能量也最多，自然能产生最强的荧光现象。
若固定荧光最大激发波长，不断改变荧光的发射波长并记录相应的荧光强度，根据发射波长与荧光强度关系可绘制出荧光发射光谱曲线，发射光谱即为通常所说的荧光光谱。发射光谱图上的荧光强度最大处所对应的发射波长即为最大发射波长λem。
理论上，同种化合物的激发光谱与紫外-可见分光光度计上得到的吸收光谱的形状应相同，实际上，由于荧光仪的光源、单色器、检测器的光谱特性，表观激发光谱与吸收光谱的形状往往存在较大差异；校正后的激发光谱的形状才与吸收光谱比较接近。
在实际测定中，激发光谱的波长扫描一般在190～650nm范围内，发射光谱的波长扫描在200～800nm范围内。化合物溶液的荧光光谱总是滞后于激发光谱，即存在斯托克斯位移。这是由于在荧光产生的过程中，存在各种形式的无辐射跃迁过程、能量损失。这也导致最大发射波长都较最大激发波长位置发生红移，即λem>λex，同时发射光的强度也会比激发光的强度减弱很多。
化合物溶液的发射光谱与吸收光谱之间存在着“镜像对称”的关系。应用“镜像对称”规则，可以帮助判别某个吸收带是属于第一吸收带中的另一振动带，还是更高电子态的吸收带。还可以用来判断体系中是否有杂散光或者杂质的存在。
许多荧光物质具有特征的最大激发波长和最大荧光波长，可根据其发射光谱和激发光谱来鉴别这些荧光物质，同时在定量分析中可作为最灵敏的测定条件。
荧光量子产率(Φ)：是指物质发射荧光的光子数与吸收激发光的光子数的比值。
发射荧光的分子数
Φ=————————————
吸收激发光的光子数
Φ值在0～l，其大小取决于物质的分子结构、状态及环境，如温度、pH值及溶剂等。测定荧光量子产率时，多采用参比法，将待测样品和已知荧光量子产率的参比荧光物质的稀溶液在同样激发条件下测荧光发射谱，并对发射光谱峰的面积积分，同时，测量该激发波长的吸光度，然后，按照以下公式计算待测样品的荧光量子产率。
Φu=ΦsFuAs / FsAu
式中Φu、Φs。——待测物质与参比物的荧光量子产率；
Fu、Fs——待测物质与参比物的积分荧光强度；
Au、As。——待测物质与参比物的吸光度。
荧光寿命(τ)：是激发光停止照射后，荧光强度衰减至原强度的e-1所需要的时间。它用来表征荧光物质S1激发态的平均寿命。荧光强度的衰变，通常遵从以下方程：
lnIo-lnIt=t/τ
式中Io—t=0时的荧光强度；
It—t=t时的荧光强度。
通过实验测出不同时刻所对应的It值，然后以lnIt对时间t作曲线，由所得直线的斜率即可算出荧光寿命(τ)值。
三、定性原理
从荧光光谱图可以获得一些特征参数，如荧光波长、强度、偏振、寿命及量子产率等信息，既可以用作组分的定性检测和定量测定，也可以用于一些物质的物理化学性质表征。
荧光物质的激发光谱和发射光谱特性(如谱图形状、最大峰位置等)、荧光强度及荧光量子产率等参数与物质的结构密切相关，将样品的这些信息与某标准物质进行比对即可进行物质的定性鉴定。
能产生荧光的物质，其分子结构中必须具有吸光的特征官能团。在芳香化合物及其与金属离子形成的配合物分子中，存在大的共轭π键或刚性的平面结构，可有效地吸收紫外光而产生荧光，因而常作为典型的荧光体。此外，荧光体的分子结构中芳杂环的数目越多，荧光峰越向长波长方向位移，荧光强度增加。在共轭环数相同下，具有线性环状结构的化合物比非线性环状结构的化合物的荧光波长要长一些。
具有平面刚性结构的荧光体分子通常具有较高的荧光效率，有利于增强分子刚性结构的因素都会增加物质的荧光强度。比较酚酞和荧光素可知，在荧光素中氧桥将三个芳环固定在一个平面，分子的共平面性增强，π电子的共轭度增加。在紫外光的照射下，荧光素可产生更强的荧光现象，酚酞的荧光则很弱。
取代基的性质也会影响荧光体的荧光特性和强度。芳烃、杂化化合物上的取代基改变常会引起激发光谱、发射光谱、荧光效率发生较大改变。一般说来，给电子取代基如NH2、一NHR、一NR2、一NHR2、一OH和一CN等都会使化合物的激发光谱、发射光谱的波长向长波方向移动，荧光效率提高；引入吸电子基团如一CO、一COOH、一CHO和一NO2等将使化合物的荧光强度减弱；引入邻位和对位取代基增强物质的荧光，引入间位取代基则会抑制荧光。
此外，一些环境因素如溶剂性质、介质的酸碱性、溶液温度等因素也会对荧光强度、荧光光谱的形成产生影响，不多赘述。
四、定量原理
对于某种荧光物质的稀溶液，溶液的荧光强度F和溶液吸收光能的程度以及物质的荧光效率有关：
F∝(Io一It)→F=K'(Io一It)
It一Io×10-εbc
式中K'——常数，取决于荧光物质的量子产率Φ；
I0——入射光强度；
It——透过溶液后的光强度。
根据朗伯-比耳定律：
F=K'(Io一Io×10-εbc)=K'Io(1一e-2．303εbc).
式中ε——荧光体的摩尔吸光系数；
b——样品池厚度；
c——荧光体的浓度。
当2．303εbc≤0．05时(浓度很小，溶液较稀时)，
F=K'Io×2．303εbc
对于荧光物质的稀溶液，当Io及b一定时，
F=Kc
即在低浓度(2．303εbc≤0．05)时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度呈(线性)正比关系。此即为荧光定量分析的基础。荧光强度正比于浓度仅限于溶液浓度极稀的情况，在较浓溶液中，该关系将不复存在。
与吸光度法相比，荧光分析法具有更高的灵敏度。对于低浓度样品，荧光分析法具有很大优势，准确度比吸光度法高100倍。原因在于荧光分析法是以荧光自身作为信号，很小的荧光也能被检测到，而且，荧光波长不同于激发波长，它不会受到激发光的影响。
