双转盘共聚焦技术：长时间活细胞3D动态观察和分析...-1
一、ELISA和流式的痛点
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅识别某一特定抗原表位的抗体，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等众多优点。单克隆抗体技术的问世经历了人鼠嵌合单抗、人源化单抗阶段，这些工程改造抗体不仅为免疫学领域带来了一次革命，而且在生物医学的各个领域得到极广泛的应用。如今在临床上，单克隆抗体也被广泛用于肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病的治疗。
在单抗药物研发的早期阶段，目前普遍的共识是：抗体是筛出来的！这就要求对整个筛选规模的通量和自动化有较高的要求，并在合适的方法学模型下“大浪淘沙”，获得真正有效的hit！然而，目前单抗药筛选方法无论是ELISA还是FACS，虽然沿用多年，但都存在种种缺陷和不足：
1.整个样品准备过程流程复杂，步骤繁琐，中间涉及到多次的离心、洗涤、孵育再离心和洗涤孵育的过程，费时费力。
2.ELISA：具备一定的通量并能实现自动化，但是实验结果基于纯化的包被抗原，无法获得符合真正生理情况下细胞水平的数据，往往导致假阳性过高，一般只作为初筛。
3. FACS：通量较低，虽有高通量的流式细胞仪问世，复杂繁琐的样品准备流程依旧是个短板，无法满足日益增加的筛选通量需求。此外FACS容易堵塞，需要清洗，维护麻烦，更无法实现机械臂整合后的自动化。
二、mirrorball：一步法，真正的免洗
由于ELISA和FACS的种种缺陷，英国著名的创新实验室自动化仪器厂商SPT
Labtech为此研发了新一代的抗体药物筛选平台mirrorball，其独有的均相混合即读模式（Mix &
Read）是专门为细胞水平的高通量抗体筛选所设计。实验时，只需将细胞（无论是贴壁还是悬浮）或微珠、待测的抗体（如杂交瘤上清）以及荧光二抗混合在一起孵育，直接读板，获得数据，中间不需要任何洗涤的步骤。
真正的一步法检测
mirrorball 免洗原理：底读+双染
首先，mirrorball的激光只会读取沉降到微孔板底部的细胞，从而避免细胞上方背景荧光二抗的干扰。
仅排除上方的背景信号是不够的
其次，用活细胞染料如Dio或CFSE标记细胞，加入待测的一抗以及相应的红色荧光二抗如Alexa647，同时能检测到绿色和红色信号的细胞即为阳性结合，红和绿的共定位，在仪器中显示为黄色信号，从而排除背景的荧光二抗。
双阳的共定位细胞即为阳性孔
三、mirrorball主要应用
1. 针对细胞表面抗原的抗体筛选：这是mirrorball最常见也是最广泛的应用。例如在感兴趣靶点的细胞上，加入待测的一抗如杂交瘤上清、细胞染料和荧光检测二抗，中间无需任何洗涤过程，孵育1-2小时后直接读板检测，同时有细胞和荧光二抗共定位信号的孔即为阳性结合孔。
384孔杂交瘤筛选workflow
384孔板结果，绿色为阳性孔
