结核病实验室诊断技术
1 结核病实验室检测方法
1. 1 病原学检测
1. 1. 1 痰涂片镜检 是确诊的依据, 也是发现结核病最经典、最有效的手段( 尤其是对肺结核) 。优点是操作简单, 快速。但此法受限制较多, 比如: 标本采集时间, 标本质量好坏, 是否停抗结核药都直接影响结核菌阳性结果, 对于含菌量少的病例( 如结核性脑膜炎) 检出率就更低, 降低其价值, 另外, 即使涂片阴性也不能排除结核病。染色常采用萋——尼抗酸染色, 此法阳性检出率至少要104/ ml, 阳性率仅为30% 左右, 阳性说明抗酸杆菌存在, 而不能区分是结核杆菌还是非结核杆菌, 由于我国非结核杆菌发病较少, 故此法对诊断结核病人有重要意义。
对L 性抗酸菌常采用改良抗酸染色, 有研究发现, 在慢性病灶内结核杆菌以L 型为主, 此时表现为非特异性淋巴结炎的病理改变, 通过IK 染色, 检出率高达67% , 说明染色法有助于提高结核病的病原学诊断。荧光镜检有更高的灵敏度, 对于含菌量少的病例, 检出率高于一般显微镜的检出率, 且所需检查时间比使用一般显微镜检查少一半多。
1. 1. 2 分离培养 由于结核分支杆菌生长缓慢的特点, 使此法耗时费力, 极不适宜于临床诊断的需要。故采用了改良罗氏和BACTEC 技术。二十世纪70 年代中后期建立起来的BACTEC 技术使结核杆菌快速培养成为可能, 缩短检测时间。缺点是: 虽然灵敏度高于传统方法, 但应注意其特异性, 且存在同位素污染, 国外已淘汰。目前应用的是新一代BACTEC 培养技术, 采用BACTEC MGIT960 仪测定, 解决了污染这个问题。从实际应用看, 许多医院缺乏开展此技术的条件, 故还不能完全取代传统的结核分支杆菌培养的方法。
1. 2 免疫学检测
1. 2. 1 结核菌素试验及其他抗原皮肤试验 结核菌素试验( OT 试验) 是一种传统的结核病诊断试验,主要用来了解被试者是否感染了结核分支杆菌或作为有无结核病的辅助依据, 在结核病流行病学方面,可以作为人群感染后结核的危险度的指标。同时, 也是检测卡介苗接种效果的一种方法。缺点是: 由于是一种间接诊断结核病的方法, 假阳性率高, 极不易标准化。现在主要用结核菌素纯蛋白衍生物( PPD)作检测。随着人们对肺结核分支杆菌认识的深入, 在研究区分结核分支杆菌感染与非结核分支杆菌感染的PPD 试剂已取得了实质性进展。这类制剂有作为菌种鉴定前的筛选手段应用于临床的前景。PPD试验作为一种检测细胞介导的免疫应答方法, 已得到广泛的承认, 但BCG 接种使用PPD 试验很难对M.TB 感染作出诊断。PPD 试验目前在早期诊断及鉴别诊断结核病方面还是一种重要的方法。
Nakamura 及其同事最近报道了MPB64 分支杆菌抗原采用铁复发应用于活动性结核检测, 该实验总的结论为: 对活动性结核的敏感性为98. 1% , 特异性为100% , 准确性为98. 9%。
1. 2. 2 免疫血清学检测 众多学者已证实, 结核病患者的免疫规律为: 病变重, 受损范围大者, 细胞免疫功能弱, 抗体产生多 。即细胞免疫随病情加重而减弱, 体液免疫随病情加重而增强。明显表现为细胞免疫与体液免疫分离的现象。因此, 从70 年代建立了ELISA 法后, 形成了很多以检测结核抗体为主的免疫血清学检测方法, 在现代结核病的快速诊断中发挥着重要作用。
(1) 酶联免疫吸附法( ELISA 法) 从临床角度看, 此法应用最广泛。但会因观察对象不同, 检测使用的抗原不同, 质量控制不易等因素影响, 结果差异较大。, 不少学者认为, 此法是目前较为成熟的血清学诊断方法, 不失为结核病有意义的辅助诊断指标之一 。对菌阴肺结核与肺外结核的诊断也同有前途。
(2) 结明实验(Mycodot) 是通过测定血清中之阿拉伯甘露糖(LAM) 抗原达到辅助诊断的目的。只有当患者为活动性结核病时, 才有阳性反应, 对健康人, 受过感染者( 结素试验阳性) 以及卡介苗接种者都是阴性反应。该法不但特异性, 敏感性高, 且标本采集方便, 方法简单, 快速, 可靠, 用肉眼判断实验结果, 无需实验仪器, 便于基层医院推广。缺点: 是一种间接诊断结核病的方法, 假阳性率高, 尤其对肺外结核的诊断, 应综合判断。
(3) ICT-TB 卡 是一种免疫色谱法, 用于检测血清中抗结核分支杆菌抗体的体外免疫诊断实验。与其他血清学检测方法不同的是, 它不是检测单一抗原抗体, 而是在一次实验中同时检测血清标本中5种特异性抗体, 弥补了宿主体液免疫反应的差异性。国内一些学者应用此法对结核病的诊断价值作了探讨, 显示该法有较高特异性, 能快速检测结核抗体对结核病的诊断及鉴别有较好临床价值, 并且操作简单, 快速, 无需任何设备, 适用于各级医院, 尤其适用于对门诊患者做出快速诊断。
(4) 免疫胶体金标记技术( ICS) 具有快速、简便、准确的特点, 有助于提高诊断。适用于活动性结核病的诊断、涂片培养阴性有临床症状者, 肺癌与其他肺部疾患的鉴别诊断, 结核病化疗动态观察, 艾滋病混合感染者。但目前该方法检测成本较高, 尚难在结核病初筛及基层普及应用。
(5) 重氮乳凝法 以新型免疫载体重氮乳胶建立的一种乳凝法。曾年华等学者对此方法的应用作了探讨、比较, 认为该法不但具有敏感、特异、操作简便的优点, 而且检测成本低廉, 在初诊中具有良好效果, 适合结核病初筛及基层普及应用 。
血清学方法为结核病的快速、准确诊断提供了广阔前景, 而寻找敏感性和特异性均高的单体蛋白作为血清学检测结核病的特异性抗原是血清学诊断的重要研究方向。正如马钰和王敬萍所言: 经历了一个世纪, 血清学法发展的道路是漫长的, 仍有许多问题要探索与研究 。
1. 3 分子生物学技术
1. 3. 1 聚合酶链反应( PCR) 1989 年Hance 等人首先将PCR 用于结核分支杆菌的检测, 1990 年我国引进该技术, 从而在我国开辟了以PCR 为代表的分子生物学技术检测结核分支杆菌的阶段 。PCR 的特点是灵敏度高, 特异性强, 简便, 快速。PCR 可以检测出1~ 100fg 纯化分支杆菌DNA, 相当于1~ 20 个结核杆菌。由于非特异反应及检测结果使用电泳法等原因, 造成一定的假阳性及假阴性结果的存在。随着对PCR 技术的改进, 定量PCR 技术越来越受到重视, 主要有AmpliSensor PCR, 谭耀驹等人已将该技术应用于结核分支杆菌的检测; 分子灯塔技术( molecular beacon) , Piatek 等将此技术已应用于结核分支杆菌rpoB 基因突变检测, 该技术主要用于同源杂交检测。定量PCR 的优势是: 1、扩增和检测均在密闭系统中, 对实验室污染的可能性大大降低; 2、扩增和检测全自动化, 工作效率大大提高 。由于特异性探针的引入, 在检测阶段去除了一些非特异性扩增产物, 无疑提高了检测的特异性, 但目前此技术在结核杆菌检测方面文献较少, 还不能客观评价临床检测价值。
1. 3. 2 核酸探针技术( DNA Probe) 主要测定结核分支杆菌同源性序列的标记核酸片断或序列。主要的类型有cDNA 探针、全染色体DNA 探针、克隆的NDA 探针、寡核苷酸探针。目前已有商业性核酸探针试剂盒用于临床鉴定一些重要的分支杆菌, 在结核分支杆菌的分子生物学研究, 细菌分类与鉴定, 流行病学调查等方面有十分重要的作用, 此法快速, 敏感, 特异 。缺点是检测的灵敏度不够理想, 因而需依赖培养或与其他技术联合应用, 不能直接检测临床标本; DNA 探针目前只能鉴定少数几种分支杆菌; 技术较复杂或需要专门仪器。
1. 3. 3 DNA 指纹技术 将结核分支杆菌的基因组DNA 采用特殊的技术切割成大小不同的片断, 电泳分离, 就可以清楚地看到象人的皮肤指纹一样具有特征性的条带, 这就是结核分支杆菌的DNA 指纹。建立结核分支杆菌DNA 指纹的主要技术有: 限制性片断长度多态性( RFLP) 方法, PCR 方法; 由上述两种技术衍生出来的几种方法, 如以RFLP为基础的( GTG) 5DNA 指纹方法, 以PCR 为基础的DR DNA 指纹方法等。RFLP 方法具有良好的特异性和稳定性, 已成为结核分支杆菌株水平鉴定的主要方法; 而PCR 法简单快速, 但特异性和稳定性不及RFLP 方法, 只是作为RFLP 方法的补充。由于选用的结合分支杆菌基因组DNA 特征片断不同, 所形成的指纹图谱不同, 目前大多采用的是Van Embden 等的IS6110为基础的DNA 指纹图谱。此法可以在种、株水平结核分支杆菌进行鉴定, 在流行病学研究和耐药检测方面已取得了很多成果, 对基因组的研究在快速检测耐药基因和鉴别非结核分支杆菌更有高时效性 。随着DNA 指纹标准方法的推广, 在全球范围追踪结核病传染源, 查证传播途径, 筛选高危人群的工作等应用前景广阔。但由于琼脂糖凝胶电泳难以辨别众多带谱, 结果不理想, 影响了此法在临床上的应用。
1. 3. 4 DNA 芯片技术 将结核分支杆菌DNA 的保守片段分段固定在芯片上, 与结核分支杆菌DNA 杂交, 以检测结核分支杆菌。设计的集成化, 微型化和操作的并行性, 使得对数千个基因表达情况的同时分析或基因性检测成为可能。目前还未被广大的专业技术人员掌握, 但有广泛的应用前景, 在疾病遗传因素的解析、治疗疾病以及发现并证实药物作用的靶位点等方面将极有价值。
2 现代结核病诊断的新特点
2. 1 多种方法联合应用诊断, 优势互补, 提高检出率
如王国斌等学者探讨了使用痰聚合酶链反应( PCR) 检测TB- DNA 的方法 , 使用酶联免疫吸附实验检测血清结核分支杆菌胞壁糖脂免疫球蛋白( LAM- IgG) 、卡介苗免疫球蛋白G( PPD- IgG) 、结合特异性免疫复合物( SCIC) 及PPD 皮试5 种方法联合用于菌阴肺结核的诊断结果显示, 联合检测阳性率明显增加, 而特异性仅稍降低, 对于菌阴肺结核, 为探讨敏感性和特异性均高的方法, 联合检测已成为人们探索的新领域 。
2. 2 对原有方法的改进、拓宽
2. 2. 1 寻找特异性, 敏感性高的包被抗原 特异的抗原是提高免疫学检测敏感性的重要环节。十几年来, 国内外学者一直从结核分支杆菌培养滤液中提纯蛋白质Ag 进行了多方面的研究。近年来, 利用基因工程技术克隆表达了多种结核分支杆菌分泌性抗原, 如PMT63, ESAT- 6,MPT64, 38kDa 等。研究表明, 这些分泌蛋白参与结核病的免疫反应 。因此, MPT63 等抗原作为血清学诊断的新型Ag 正在被研究。
2. 2. 2 免疫检测指标的丰富 传统免疫学方法主要检测结核抗体、抗原。随着分子免疫学的深入发展, 检测的内容丰富化, 如: 对活动性结核标志物( ATM) 的检测 ; 全血IFN- γ检测等。董德琼等人的研究也表明, 血清TGF- β的检测可作为反映结核病人免疫功能判断病情。
2. 3 结合其它学科技术的发展
单纯的细菌学检查、免疫学检查、基因诊断方法都不可能适应现代疾病的诊断, 随着人类科学技术的进步, 对疾病认识的深入, 疾病的诊断技术也在不断改革, 以适应发展。如传统的免疫学检查与放射学检查结合, 与计算机的结合; 基因芯片技术与压电传感器技术形成的电基因传感器芯片就是一类新兴检测技术 。
3 展望
二十世纪90 年代末, 结核分支杆菌全部基因组测序工作已完成。进入二十一世纪, 医学界有人大胆推测, 医学将进入分子基因时代, 而基因研究将进入后基因时代 , 充分利用基因组丰富的信息, 运用一切分子生物学技术, 有望找到新的诊断方法。
