细胞凋亡检测实验——DNA 片断化检测
| 实验方法原理 | 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA 在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300 kbp 长的DNA 大片段, 或180~200 bp 整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNA ladder）。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA 后，用32P-ATP 和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA 标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder 的形成。
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| 实验步骤 | 一、大分子染色体DNA 片段的测定 细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300 kbp 长的DNA 大片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA 分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA 的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA，DNA 像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为"爬行"。因此，细胞凋亡早期产生的50~300 kbp 长的DNA 大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大的DNA分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。DNA分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当DNA 分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA 就可以按其分子量大小分开。 收获细胞（1X107）沉淀?细胞裂解液13000 rpm′5 min, 收集上清1%SDS和RnaseA（5 mg/ml）56 °C，2 h。蛋白酶K（2.5 mg/ml）37 °C，2 h，1/10 体积3 M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA，4 °C过夜。14000 rpm′15 min最后将沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer 1.2 %琼脂糖凝胶电泳，EB染色并照相。
三、凋亡细胞DNA 含量的流式细胞计分析 收集细胞，70 %冷乙醇（in PBS）4 °C 固定过夜，PBS 洗涤，1000 rpm′10 minRNase A（0.5 mg/ml）37 °C 消化30 min PI（50 mg/ml）染色，室温避光15 min，FACScan 分析DNA 亚二倍体的形成及细胞周期的变化。
四、ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH) 敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。 展开 |
