凋亡细胞核DNA片段检测方法进展（一）
摘 要：当今生物学领域的研究一个热点之一是细胞凋亡。开展对细胞凋亡的研究，首先要解决是方法学问题。作者从凋亡细胞的特征性核DNA片段检测着手，阐述了多种凋亡细胞核DNA片段检测方法以及近年来的一些新进展。
细胞凋亡（apoptosis）又称细胞凋谢或称程序性细胞死亡（Programmed cell
death，PCD），是有别于细胞坏死而受基因控制的一种主动性细胞自杀过程。对细胞凋亡的研究已成为当今生物学领域的热点之一。开展对细胞凋亡的研究，首先要解决的是方法学问题。根据凋亡细胞的生化特征检测组织或培养细胞中的细胞凋亡发生状况，是一种特异而敏感的方法，特别是与其他方法（如流式细胞仪）结合后，可以对细胞凋亡进行定性和定量的研究。下面根据生化特征检测细胞凋亡的方法学及有关进展作一综述。
1 琼脂糖凝胶电泳
细胞凋亡最显著而具特征性的生化特征是DNA降解为大约由180～200
bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段，琼脂糖凝胶电泳可见特征性的“梯状（Ladder）”带。有些类型的细胞发生凋亡时DNA并不降解成寡核小体片段[1]，有证据表明[1,2]：凋亡细胞的DNA降解，早先可产生一些DNA大片段，可以是30～50、200～300、700
kb或更大，随后再降解成180～200 bp的寡核小体片段或不出现这一步[3]。根据上述细胞凋亡的生化特点，列举几种常见的琼脂糖凝胶电泳方法。
1.1 常规的琼脂糖凝胶电泳
1.1.1 经典的琼脂糖凝胶电泳[3]
该方法主要用蛋白酶K消化和酚、氯仿，异戊醇抽提去蛋白，无水乙醇和乙酸钠沉淀DNA，然后行琼脂糖凝胶电泳。该方法提取的DNA纯度高。缺点是过程较复杂，所需时间较长，小片段DNA易丢失，且实验人员需与酚、氯仿等有毒物质接触。
1.1.2 简易的DNA提取方法[4,5]
有许多种提取凋亡细胞核DNA的方法，如乙醇固定、磷酸-枸橼酸（PC）缓冲液提取法，TritonX-100低渗处理细胞DNA小片段提取法等。这些方法的特点是方法简便、快速；选择性提取小片段DNA，因而敏感性较高；无需与酚、氯仿等毒性试剂接触。
1.2 [6]反转电场凝胶电泳（Field inversion gel
elec-trophoresis，FIGE）由于细胞凋亡的某一阶段可产生大片段DNA，用常规的琼脂糖凝胶电泳是检测不出来的，这时得用FIGE技术，FIGE对只产生大片段DNA而没有寡核小体片段产生的细胞凋亡特别有用，结合形态学改变，可检测较早期的细胞凋亡。
1.3 彗星鉴定（Comet assay）[7] 彗星鉴定又称单细胞凝胶电泳鉴定（Single cell gel
assay）或微凝胶电泳（Microgel
electrophoresis）。由于电泳的结果很象彗星，故名“彗星鉴定”。主要用于检测少量单个细胞（Individual
cells）DNA损伤的程度。主要分为两大类：中性彗星鉴定和碱性彗星鉴定，分别检测双链和单链DNA片段。彗星的形成是因为有损伤的DNA在电泳中从细胞核中释放出来发生迁移，有多种方法估计和定量彗星形成的类型。一种常用而准确的方法是分析一种称之为tail
moment的终点（endpoint）现象，包括了尾长（Tail length）和尾部中总DNA的部分。分析tail
moment可同时得知最小的发生了迁移的DNA（反映在彗星尾的长度）和被释放或断裂的DNA片段（通过尾部DNA的荧光强度反映出来）。
彗星鉴定可用于检测凋亡细胞寡核小体片段，在中性和碱性彗星鉴定中其终点现象都很明显。在标准的碱性彗星鉴定中，凋亡细胞DNA片段迁移的长度是没受损伤细胞的几倍。彗星鉴定检测DNA断链极为敏感，有人认为比流式细胞仪方法还能更早地检测出凋亡细胞。特别适用于少数甚至单个细胞的检测。
1.4
琼脂糖凝胶电泳的定量检测常规琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞中的寡核小体片段的缺点是敏感性不高，且不能定量。有学者[8]在常规琼脂糖凝胶电泳的基础上，将放射性同位素P32标记寡核小体片段的5’末端，在X光片上放射自显影成像，并用特定的设备分析计算进行定量研究。该方法的优点是灵敏度极高，是常规琼脂糖凝胶电泳的1000～2000倍，能检测出极微量的寡核小体片段（pg级），且能进行定量。但因需与放射性同位素接触，又需要一定的专门设备，从而其应用受到限制。
2 原位末端标记（in situ end-labeling，ISEL）技术
原位末端标记是将掺入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在某种酶的催化下与凋亡细胞中的单股或双股断链相结合，并通过一定的显示系统使之显示出来。通常有两种方法，一是末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记，简称TUNEL鉴定；二是DNA聚合酶I或Klenow大片段介导的原位缺口翻译，简称ISNT鉴定。在不考虑所使用的酶时，统称为原位末端标记（in
situ
end-labeling，ISEL）[9,10]。这两种方法用于检测组织或培养细胞中凋亡细胞的核断裂片段，可以检测早期的细胞凋亡[10]，且特异性和敏感性都是较高的。特别是近年来，通过在方法学上的不断改进，其敏感性有了很大的提高。就其敏感性而言，TUNEL鉴定高于ISNT鉴定[10,11]。根据标记在dUTP上的标记物和显示系统的不同，可分别作组织切片凋亡细胞和培养细胞涂片的原位检测及培养细胞的流式细胞仪检测。
2.1 ISNT（in situ nick translation）[12,13，14,15]
ISNT鉴定的基本原理是基于细胞凋亡时产生DNA断链，断链有一粘性末端，一条含有游离的3''羟基末端，另一条有伸出的5''末端。利用Klenow大片段的5''-3''聚合酶活性，可将外源掺入的生物素-dUTP从3''羟基末端起始经5''-3''方向连接在断端上，通过带有辣根过氧化物酶的卵白素（avidin）与之结合，经DAB显色，便可观察到细胞是否存在有核苷酸掺入的DNA断端。该方法主要用于组织切片的原位检测，也可用于细胞涂片的检测。对组织切片进行预处理是必要的，可以提高该方法的敏感性和消除假阳性及非特异性染色
2.2 TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick
end-labeling，）
TUNEL鉴定的原理与ISNT鉴定相似，所需试剂也与ISNT鉴定相似，不同的是介导的酶是TdT，无需dATP、dCTP、dGTP。用于组织切片和培养细胞的检测，其敏感性较ISNT要高。近年来，该方法经过众多的学者的改进，其特异性特别是敏感性方面有很大的提高。就提高敏感性而言，组织切片和细胞的预处理是很重要的。Negoescu等[9]比较了几种固定剂（包括甲醛、多聚甲醛、丙酮、B5、Bouin’s固定液和甲醇）和预处理方法（包括去垢剂、蛋白酶和微波炉处理）对敏感性的影响，结果显示：在没有作预处理时，TUNEL鉴定的敏感性很差，只有3%～17%的具有凋亡细胞形态学特征的细胞被标记上；在使用了预处理方法后，无论何种固定剂，其敏感性都有所提高。比较了去垢剂（如Triton）、蛋白酶、蛋白酶结合微波炉和单独微波炉预处理组织和细胞，以单独微波炉处理的效果最好。可将敏感性提高4～30倍，特异性没有多大的改变。
