免疫组化具体操作步骤
免疫组化是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素） 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术（immunohistochemistry）或免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）。
一、免疫组化操作
1、石蜡切片脱蜡至水。
2、3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
3、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 【如需抗原修复，可在此步后进行，
抗原热修复
（1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
（3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,Chromogranin A,Cyclin,ER,Heat shock protein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,TopoismeraseⅡ等。
4、5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。
5、PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
6、滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。
7、PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
8、滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素（通过化学发光反应发出的光在特定仪器上进行测定）工作液，37℃孵育10-30分钟。
9、PBS 冲洗，5 分钟x3 次。
10、显色剂显色 3-15 分钟（DAB或NBT/BCIP ）
11、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
二、免疫组化（ LP 法）操作步骤
1. 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行
2. 缓冲液洗 3min/2 次。
3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。
4. 缓冲液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block , 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。
（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 - 10% 正常羊血清，这一步可以省略。）
6. 缓冲液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 - 2 小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）
8. 缓冲液洗 5min/2 次。
9 . 滴加 Primary Antibody Enhancer（ 增强子 ） , 在室温下孵育 20 分钟。
10 .缓冲液洗 5min/2 次。
11 .滴加 HRP Polymer（ 酶标二抗 ） ,在室温下孵育 30 分钟。
（注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。）
12 .缓冲液洗 5min/2 次。
13 .向 1ml DAB Plus Substrate （ 或 AEC Plus Substrate） 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 - 15 分钟。（具体时间由染色深浅决定。）
14 .自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。
