生物标志物研究与早期药物研发基因表达分析功...（三）
靶基因表达标准化参考基因选择
对于相关定量分析来说，通过参考基因表达进行靶基因表达标准化。理想情况下，标准化处理应该能够补偿
RNA/cDNA起始量变异情况，以及cDNA合成或 PCR
扩增中潜在抑制剂的作用。参考基因作为内源性样本材料对照，工作流中，与靶基因一同被处理。为获取可靠结果，标准化中选择合适的参考基因非常重要。合适参考基因即：在感兴趣的样本中，性能比较稳定的、非表达调节基因（4，5）。如图
1，于 4 个参考基因中选择出 2 个基因作为参考基因。
 图 1：9 种细胞系 4 种参考基因表达分析。本研究 9 种细胞系 4 种参考基因绝对Cq值（重复检测）作图。使用同样cDNA混合液进行PCR。分析 显示，两个参考基因模式相似，参考基因为：ALAS1 （氨基酮戊酸盐、Δ-、合成酶 1）与 HPRT（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶 1）。第 3 个基因：MRPL19（线粒体核糖体蛋白 L19）性能非常具有可比性，第 4 个基因：G6PDH（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶），具有独特模式。因此，我们将 ALAS1 与 HPRT 作为参考基因，进行相关基因表达分析。 |
差异基因表达结果
各种实体肿瘤 9 种细胞系 NF-kB panel与 RNA
基因表达分析中，通过Cq值标准化处理，以及联合使用 2 个参考基因（RG），确认出 35 个差异表达基因。Δ Cq计算如下：Cq_RG –
Cq_靶值，Cq_RG是参考基因：ALAS 与 HPRT Cq均值。9 种细胞系 TWEAK 受体（Fn14）差异表达模式见图 2
体内移植片研究对RealTime ready NF-kB定制型多孔检测板体外确认的潜在药效学标志物进行确认
应用治疗复合物后，药效学生物标志物（功能性生物标志物）会发生改变，并显示治疗反应（6）。确定治疗复合物相关剂量非常重要。参数选择后，使用体内小鼠模型，对体外确定的假设生物标志物进行验证。使用移植物来源的新鲜冻存（FF）组织样本对所选生物标志物进行检测。图4显示相关安慰剂对照的抗-
TWEAK 处理移植物小鼠潜在药效学生物标志物相关基因表达比率。研究发现，用药后，基因表达降低。
 图 2：9 种细胞系TWEAK受体基因表达。相关比率（log 2 量表）计算如下：ΔCq = Cq_HK – Cq_Fn14。以细胞系与时 间点作图。进行 ALAS1 与 HPRT1 标准化处理。 ACHN：人肾细胞腺癌 Caki：人肾透明细胞癌细胞系 SJSA：人骨肉瘤；多源肉瘤 PANC-1：人胰腺癌；上皮样细胞系 MDA-MB 231：人乳腺癌模型；乳房；乳腺；胸腔积液 AsPC-1：人胰腺腺癌 SK-MES-1: 人肺癌 NCI-H322M: 细支气管肺泡腺癌 22RV1: 人前列腺癌移植片细胞系 |
通过RealTime ready NF-kB定制型多孔检测板体外肿瘤细胞系与体内移植物研究，可发现潜在反应性预测标志物。
反应性预测（临床反应）生物标志物可显示：个体对治疗性复合物是否会产生最佳反应性（6）。著名事例：HER2/neu与Herceptin。
确认潜在反应性预测生物标志物，所选9种细胞系相关基因表达（参见图
2）与小鼠模型移植肿瘤生长抑制之间具有相关性。1或24小时收集的细胞系为未处理细胞系，使用抗-TWEAK进行小鼠处理。细胞系基因表达结果表明，重现性非常高，处理时间或培养对表达结果无影响。小鼠模型肿瘤生长抑制（TGI）与细胞系潜在生物标志物相关基因表达之间相关性较高，见图3。
 图 3：细胞系中反应性预测生物标志物 1 基因表达与体内肿瘤生长抑制(TGI)结果之间相关性较高。RealTime ready NF-κB 定制型多孔检测板中基因表达结果与体内 TGI 作图。“生物标志物1”基因表达增加与 TGI 具有相关性。 |
图 4：体内小鼠移植片模型中，抗- TWEAK 治疗反应与潜在生物标志物 2 相关基因表达比率作图。log 2 量表（n = 5 只动物）基因表达中值作图
